[发明专利]构建三维工程化神经组织的方法、三维工程化神经组织及其用途

权利要求书

1.一种构建三维工程化神经组织的方法，其特征是，包括以下步骤：

一、分离培养动物神经干细胞；

二、施加生理电场；

将所述步骤一中分离培养出的神经干细胞传代至第5代，取直径100～200μm的神经球离心备用，将Matrigel冰上预融备用，通过生理电场施加设备连续施加生理电场刺激7天～14天，每天1小时～2小时；

三、优化适合工程化神经组织生长的培养液：以“杜氏改良Eagle培养基：营养混合物F-12”，DMEM/F12，为基础培养基；加入1/50神经细胞培养补充剂B₂₇、1/100神经细胞培养补充剂N₂、10～20ng/ml碱性成纤维细胞生长因子，bFGF以及1％胎牛血清，FBS。

四、施加生理电场7～14天，得到三维工程化神经组织。

2.如权利要求1所述的构建三维工程化神经组织的方法，其特征是，所述动物为小鼠。

3.如权利要求2所述的构建三维工程化神经组织的方法，其特征是，所述步骤一包括以下步骤：

(一)取胚胎14～16天小鼠全脑，放入冷DMEM/F12基础培养基中，解剖镜下移去脑脊膜后将胎脑放入平皿中，用眼科纤维镊子机械切割脑组织成组织碎块，将组织碎块转移到离心管；

(二)离心去上清移除脑脊膜碎片，将剩余的组织碎块中加入神经干细胞生长培养基,用吸管轻柔的吹打分离细胞。静止后将细胞悬液上清通过cell strainer获得单细胞悬液；

(三)调节细胞浓度2～5×10⁴cells/ml,将细胞种到培养瓶中，每3天换一次液，每6～7天传代。

4.如权利要求3所述的构建三维工程化神经组织的方法，其特征是，所述步骤二包括以下步骤：

(1)用玻璃刀将22mm×22mm盖玻片切割成相同的两个22mm×11mm小盖玻片：盖玻片1和盖玻片2，高压灭菌；

(2)用高真空硅脂将所述盖玻片1和盖玻片2平行黏贴在平皿底部中间，确定盖玻片底部均匀的铺满薄层硅脂，保持两个盖玻片之间有1cm～2cm的间距；

(3)以1:10比例将神经球悬液加入基质胶-Matrigel中，冰上混合均匀后种入内径7mm的模具中，在37℃下静置30分钟，待Matrigel凝固成胶后，取出，进行加电小室构建；

(4)用高真空硅脂将22mm×22mm盖玻片3架在盖玻片1和盖玻片2上方，形成顶盖，用眼科镊子轻轻压盖玻片3，使硅脂均匀的黏贴在盖玻片1和盖玻片2上，在三个盖玻片之间形成一个两端开放的半封闭小室；

(5)用硅脂分别在小室开放两端的上方，盖玻片3边缘建筑平行的2道硅脂墙，再用少量硅脂封闭空隙以及连接处，确保除开放端以外，没有其它地方可以通过液体；

(6)小室架构完成后，先加入几滴培养液防止Matrigel风干；

(7)在小室开放端一侧慢慢补充适量的培养液，使得培养液从平皿一侧慢慢通过小室流入另一侧；

(8)将钻有2个直径8mm小孔的平皿盖盖到平皿上，使两个小孔分别在小室开放端的两侧；

(9)准备玻璃桥：直径6mm长26cm的玻璃管高温弯曲成等臂U管，内充以5～10％小牛血清DMEM/F12为溶液配置的2％琼脂胶；

(10)准备2个100ml玻璃瓶，内装50ml 5～10％小牛血清的DMEM/F12，pH 7.4；

(11)2个玻璃桥的一端分别与2个玻璃瓶连接，另一端分别放入平皿盖子上的2小孔；

(12)将无菌的Ag/AgCl电极分别放入2个玻璃瓶中，并分别通过正负电线与直流电源连接；

(13)将直流电源电压设定为‘0’，打开电源，用电压表测量小室两端的电压，调节电压至要求电压值；

(14)每天施加100～150mV/mm生理电场2小时，连续施加7～14天。

5.如权利要求3所述的构建三维工程化神经组织的方法，其特征是，所述步骤三中每隔2天更换新鲜的工程化神经组织生长培养液。

6.一种三维工程化神经组织，其特征是，所述的三维工程化神经组织由权利要求1-5任一所述构建三维工程化神经组织的方法构建而成。