[发明专利]一种猪瘟和非洲猪瘟双重数字PCR检测技术及其专用试剂盒

说明书

本发明公开了一种猪瘟和非洲猪瘟双重数字PCR检测技术及其专用试剂盒。本发明提供的试剂盒包括引物探针组合CSF‑F1R1P1和ASF‑F1R1P1；所述引物探针组合CSF‑F1R1P1由CSF‑F1、CSF‑R1和CSF‑P1组成；CSF‑F1为序列1所示；CSF‑R1为序列2所示；CSF‑P1如序列3所示；所述引物探针组合ASF‑F1R1P1由ASF‑F1、ASF‑R1和ASF‑P1组成；ASF‑F1为序列4所示；ASF‑R1为序列5所示；ASF‑P1如序列6所示。本发明对于猪瘟病毒和/或非洲猪瘟病毒的防控具有重大的应用价值，有助于从源头控制疫情、有效预防猪疫病的大规模爆发。

技术领域

本发明属于病毒检测领域，具体涉及一种猪瘟和非洲猪瘟双重数字PCR检测技术及其专用试剂盒。

背景技术

猪瘟(Swine fever，SF)又名猪霍乱(Hog Cholera，HC)，我国俗称烂肠瘟。欧洲为了区别于非洲猪瘟称其为古典猪瘟(Classical swine fever，CSF)。猪瘟是由猪瘟病毒(Classical swine fever virus，CSFV)引起的一种高度接触性病毒传染病，其特征是小血管壁变性、内脏器官多发性出血、坏死和梗死。传播快、流行广、发病率和死亡率高，危害极大。世界动物卫生组织(OIE)将其列为法定报告疫病，我国2008年新修订的《一、二、三类动物疫病病种名录》将其列为一类动物疫病。

非洲猪瘟(African Swine Fever，ASF)是一种由非洲猪瘟病毒(African swinefever virus，ASFV)引起的传染病，可影响所有年龄的猪，引起出血热，急性发病时的致死率可达100％。非洲猪瘟严重威胁养猪业生产，并且因疫情引发贸易限制，对国际贸易产生重大影响。ASF具有极强的跨境传播能力，已引起各国政府和国际组织越来越多的重视。我国在2018年8月之前从未发现过ASF，并始终将其列为重点防范的外来动物疫病。

目前，最常用的核酸检测方法有RT-PCR和荧光RT-PCR。RT-PCR和荧光RT-PCR虽然较之以往方法具有特异性强、灵敏度高、重复性好，且自动化程度高等特点，但是上述方法均只能实现定性和半定量的检测，无法对病毒核酸进行精确定量，在灵敏度和敏感性特异性上仍存在一定的局限性。

数字化PCR(Digital PCR，dPCR)的概念早在1999年就由Bert Vogelstein采用并发表相关文献，其初衷是为了能够从临床样品(如尿液、淋巴液、血浆、粪便等)大量的正常体细胞中检测出微量的突变细胞，但由于当时能用于稀释样品的耗材只是384孔板，因此还不能非常好地体现数字PCR的核心理念——“无限稀释”(terminal dilution)。

Bio-Rad公司的QX200系统核心的微滴化技术能够将一份样品分成20,000个纳升级的微滴，本质上将传统定量PCR的一个test变成20,000个test，大大提高了核酸序列检测的灵敏度和精准度，是对“无限稀释”这一概念的完美演绎，其方法原理可称为微滴式数字化PCR(Droplet Digital PCR，ddPCR)。QX200 ddPCR系统包括两台仪器：微滴发生器和微滴分析仪，及其相关的耗材。微滴发生器将每个样品分成20,000个均匀的纳升级微滴，其中每个微滴或不含待检核酸靶分子，或者含有一个至数个待检核酸靶分子。每个微滴都作为一个独立的PCR反应器。随后微滴转移至96孔PCR板上，开展终点PCR扩增。采用微滴分析仪(droplet reader)逐个对每个微滴进行检测，有荧光信号的微滴判读为1，没有荧光信号的微滴判读为0，最终根据泊松分布原理以及阳性微滴的比例，分析软件可计算给出待检靶分子的浓度或拷贝数。