[发明专利]一种花生转基因的方法

说明书

本发明公开了一种花生转基因的方法，包括如下步骤：(1)消毒浸种，(2)切取半粒种子，(3)预培养，(4)农杆菌浸染，(5)共培养，(6)蛭石培养，(7)潮霉素筛选，(8)PCR检测。本发明直接将共培养花生种子播种在蛭石中成苗，并利用潮霉素水培法筛选阳性植株，避免了组织培养过程中复杂而繁琐的无菌操作培养以及成苗后的练苗过程。无需特殊的器材、技术和培养条件，操作过程极其简单。本发明直接对花生半粒种子进行遗传转化，大大缩短了遗传转化的时间，从浸种到成苗仅需20天。

技术领域

本发明属于转基因技术领域，具体涉及一种花生转基因的方法。

背景技术

花生(Arachis hypogaea L.)是全球第四大油料作物，也是中国重要的经济和油料作物之一。花生的遗传转化研究起步较晚，由于技术难度较大，进展缓慢。根癌农杆菌介导的基因转化是利用Ti质粒实现基因的转移并整合到植物细胞基因组中的天然转化途径之一。该转化系统由于理论机理最清楚、技术方法最成熟，已被广泛应用于花生转基因研究。近年来，花生的遗传转化研究随着体细胞再生技术的进步取得了很大进展，已经可以有目的地获得特定基因的转化花生植株。但是这些花生转化系统普遍存在着转化周期长，筛选难度大，转化效率低及重复性差的问题。

目前已建立的花生遗传转化体系主要是基于组织培养技术，以胚小叶、子叶节、下胚轴、带子叶的胚轴等作为外植体，但是这些遗传转化体系操作复杂、转化周期长、重复性差。

中国油料作物学报2018，40(2)公开了农杆菌介导的花生遗传转化条件优化，该文献中，为建立花生快速高效的遗传转化体系,以浸泡吸水后的花生半粒种子为转化受体,利用根癌农杆菌介导法,以除草剂Basta抗性筛选及基因组DNA的bar基因PCR检测为指标,优化花生遗传转化体系。研究结果表明,在侵染悬浮液中加入1mmol/L二硫苏糖醇(DTT)提高了农杆菌介导的转化效率(最高提升36.5％)；与YEB培养液相比,AB重悬液的使用显著提高了农杆菌的转化效率(最高提升19.3％)；农杆菌菌液OD_(600)为0.7时转化效率最高；基因型显著影响转化效率,EXP27-1516的转化效率为69.03％,显著高于14AU01(56.67％)；以花生半粒种子为转化受体,从种子培养到形成茁壮根系仅需8周,明显短于子叶节转化所需的13周。优化后的农杆菌介导的花生遗传转化体系为花生转基因研究提供了重要的研究工具。即使如此，由于该方法将半粒种子接种到MS培养基上，因此，需要严格的无菌操作，而且成苗后需要练苗。更重要的是，该方法采用的质粒载体为p201B Cas9，仅含有选择标记基因(对除草剂Basta有抗性的bar基因)，没有目的基因，其实际应用价值有限。

申请号为2016111395009的中国专利申请公开了利用横切花生种子快速获得转基因花生的方法及其应用，包括以下步骤：1)取处于对数生长期的含有外源基因的农杆菌，重悬于培养基中，得到转化菌液；2)取成熟的花生种子，浸泡20-30分钟，萌发0-4天；然后在离胚根0.2-0.5cm处将所述花生种子横切为两半，选择含有胚根的一半，即为转化受体；3)将所述转化受体浸泡在转化菌液中，侵染20-50分钟，接着取出转化受体，吸干表面的液体，再置于吸水纸上，于22±2℃暗培养3-4天，得到花生幼苗；培养过程中，向吸水纸上喷施含0.2mg/L的6-苄氨基腺嘌呤的MS培养基，使得吸水纸保持湿润；4)将所述花生幼苗继续培养至得到花生植株，对花生植株进行鉴定，即可确定转基因植株。该方法共培养后半粒种子成苗培养过程中用的是MS培养基，需要无菌操作，成苗后需要练苗。大大的增加了成本及时间，获得转基因植株需要3个月。

发明内容

本发明所要解决的技术问题为：克服现有的花生转基因技术难度大、培养周期长、转化效率偏低等缺陷，提供一种快速、简单、高效且实用的花生转基因新技术。

本发明的技术方案为：

一种花生转基因的方法，包括如下步骤：

1.一种花生转基因的方法，其特征在于，包括如下步骤：