[发明专利]一种基于家蚕二分浓核病毒的重组质粒及其构建方法

说明书

本发明属于基因工程领域，具体涉及一种基于家蚕二分浓核病毒的重组质粒及其构建方法。本发明构建了一种携带标记基因eGFP的家蚕二分浓核病毒基因组VD2的重组表达质粒，所构建的重组质粒在不破坏家蚕二分浓核病毒VD2基因编码的前提下在加入eGFP基因的完整表达框，既不破坏家蚕二分浓核病毒VD2的编码基因，又增加分析的便捷性，避免了由于病毒基因编码框被破坏带来的实验阻力，另一方面，本发明以eGFP或RGP基因作为标记基因，能够较直观和便捷的判定转染及感染的成功与否，增加实验的便捷性。

技术领域

本发明属于基因工程领域，具体涉及一种基于家蚕二分浓核病毒的重组质粒及其构建方法。

背景技术

家蚕二分浓核病毒(Bombyx mori bidensovirus, BmBDV)是一种可以引发家蚕罹患类似昆虫浓核症的病原，BmBDV特异性感染家蚕中肠柱状上皮细胞能够引起幼虫致死性软化病。被该病毒感染的家蚕会引起空头下痢等症状且，感染病毒后的家蚕有厌食症状。该病毒与昆虫浓核病毒（Densovirus）有相似的病毒粒子特征和基因组结构。BmBDV为无囊膜的球状病毒粒子，直径约20~24nm，包含2个线性单链DNA分子，大小分别约6.5kb(VD1)和6kb(VD2)，VD1和VD2各自包装进病毒粒子，基因组末端具有反向末端重复序列。

目前还没有一种体外培养细胞系可供BmBDV感染，由于BmBDV没有敏感细胞系，对于该病毒的研究限制在家蚕幼虫上，BmBDV的增殖与基因功能研究受到极大限制，病毒的入侵和复制机制、病毒和宿主的相互作用等方面还远未阐明。因此，构建稳定高效的能拯救BmBDV的反向遗传体系尤为重要。

之前的研究中将重组质粒pVD1-NS1GFPf，pVD1-VP/GFP和pVD1-VPGFPf分别与pUC119-VD2质粒线性化共转染BmN细胞；重组质粒pVD2-mCP/GFP与pMD18T-VD1质粒线性化共转染BmN细胞；但是，GFP标记的引入破坏了BmBDV基因，不利于后续的研究。故构建一种既便于检测又不破坏病毒基因结构的家蚕二分浓核病毒基因组重组质粒，对于构建该病毒的反向遗传体系十分必要的。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种基于家蚕二分浓核病毒的重组质粒及其构建方法。本发明所提供的重组质粒在不破坏家蚕二分浓核病毒VD2编码基因完整性的前提下加入标记基因的完整表达框，增加BmBDV复制分析的便捷性。

为了实现上述发明目的，本发明所采用的技术方案是：

通过酶切酶连的方法将含有完整表达框的标记基因eGFP片段插入到VD2基因组的非编码区中。

本发明提供一种基于家蚕二分浓核病毒的重组质粒，其包含有VD2完整基因组，含有杆状病毒BmNPV的ie1启动子和sv40终止子完整表达框的标记基因片段，所述的标记基因为eGFP基因或RGP基因。

本发明还提供了一种基于家蚕二分浓核病毒的重组质粒构建方法，包括以下步骤：

（1）构建包含VD2完整基因组的pUC-VD2/PmaCI质粒：

（2）以步骤（1）中构建的pUC-VD2/PmaCI质粒为模板，设计引物序列F1和R1，F2和R2；以BmNPV和pFBDM质粒为模板构建得到pT-ie1-eGFP-sv40质粒，根据构建的pT-ie1-eGFP-sv40质粒设计引物序列F3和R3；

（3）利用步骤（2）中设计的引物序列分别进行PCR扩增，以pUC-VD2/PmaCI为模板PCR扩增分别得到上游产物片段VD2-U和下游产物片段VD2-D；以pT-ie1-eGFP-sv40质粒为模板PCR扩增产物片段L-eGFP；

（4）将步骤（3）中得到的产物片段酶切胶回收纯化，依次将酶切后的目的片段VD2-U，L-eGFP，VD2-D与pFBDM质粒载体连接得到重组质粒pFBDM-VD2eGFP。