[发明专利]嵌合苯丙氨酰-tRNA合成酶/tRNA的应用

说明书

嵌合苯丙氨酰‑tRNA合成酶/tRNA的应用，属于化学生物技术领域。本发明提出利用嵌合苯丙氨酰‑tRNA合成酶/tRNA在哺乳动物细胞和大肠杆菌中高效的实现色氨酸/酪氨酸类似物在蛋白质特定位点的插入，通过这个系统筛选到了一系列色氨酸的衍生物和络氨酸类似物。

技术领域

本发明属于化学生物学技术领域，具体涉及嵌合苯丙氨酰-tRNA合成酶/tRNA的应用。

背景技术

遗传密码扩展技术(genetic code expansion，简称GCE)拓展了合成蛋白质的砖瓦，在蛋白质上特异的引入具备新颖结构和独特性质的非天然氨基酸，从而为精准的蛋白质操控、蛋白质功能的鉴定和优化提供了强有力的工具。遗传密码扩展技术的核心是正交化的氨酰-tRNA合成酶/tRNA系统，要求不与细胞内源的氨酰-tRNA合成酶和tRNA相互识别，不影响细胞内正常的生理活动。现今，常用的氨酰-tRNA和tRNA的正交对主要有4种，但是只有来源于甲烷古菌Methanosarcina mazei或Methanosarcina barkeri的pyrrolysyl—tRNA合成酶(PylRS)/tRNA_CUA正交对可以普适的应用在细菌、真核细胞和个体中。我们前期利用蛋白质嵌合的技术将pyrrolysyl—tRNA合成酶(PylRS)/tRNA_CUA正交对普适正交的特性移植到了人线粒体苯丙氨酰-tRNA合成酶/tRNA对上构建了普适正交化的嵌合苯丙氨酰-tRNA合成酶/tRNA系统，为遗传密码扩展技术提供了新的材料。

上个世纪90年代初期，研究者发现大肠杆菌苯丙氨酸-tRNA合成酶α亚基上A294G的突变改变了合成酶底物选择性，使其可以识别卤素对位取代的苯丙氨酸。这一发现被认为是现今遗传密码扩展技术的开端。研究者进一步将酵母中苯丙氨酰-tRNA合成酶与大肠杆菌中A294对应位置T415突变为G，成功的在大肠杆菌中引入了一些苯丙氨酸和色氨酸的类似物。

左旋多巴(L-Dopa)是多巴胺和肾上腺素等儿茶酚胺类物质合成的前体，可以通过血脑屏障，已经被应用到了帕金森病的治疗中。2011年通过高精度质谱技术在组蛋白上鉴定出了这一氨基酸(酪氨酸羟化修饰)，但是至今功能未知。左旋多巴也存在于海洋贝类(MarineMussel)的足蛋白中(mfp)，并赋予了mfp黏着的特性。近期发现，左旋多巴还存在于不依赖金属的核糖核苷酸还原酶中，形成自由基催化中心，催化核糖核苷酸生成脱氧核糖核苷酸。左旋多巴极易氧化为多巴醌，可以作为正交标记的探针，发生张力驱动的氧化控制的环辛炔-1,2-醌(SPOCQ)环加成反应。位点特异性的引入左旋多巴不仅可以应用在点击化学中，还可以应用到酶功能提高和生物材料中。但是到现在为止只能在大肠杆菌中引入左旋多巴，真核细胞中的引入依然困难重重。

将具备荧光的非天然氨基酸引入到蛋白质中可以实现最小干扰的生物标记，具备广阔的应用前景。色氨酸作为组成蛋白质天然氨基酸中少有的可以产生荧光的氨基酸，已经应用到了蛋白质构象的研究中。近期研究发现，6位氰基和7位氰基取代的色氨酸(6CNW和7CNW)不仅荧光量子产率大幅提高，荧光最大发射峰也发生了红移(390nm)。已有文献报道，通过体外蛋白质合成体系将这两个非天然氨基酸插入到蛋白质，研究蛋白质构象变化。但是在细胞内插入这两个氨基酸尚未有报道。

发明内容

针对现有技术存在的问题，本发明的目的在于设计提供嵌合苯丙氨酰-tRNA合成酶/tRNA在哺乳动物细胞和大肠杆菌中实现色氨酸/酪氨酸类似物在蛋白质特定位点插入的应用的技术方案。

所述的嵌合苯丙氨酰-tRNA合成酶/tRNA在哺乳动物细胞和大肠杆菌中实现色氨酸/酪氨酸类似物在蛋白质特定位点插入的应用，所述的嵌合苯丙氨酰-tRNA合成酶的基因序列如SEQ ID NO.4所示。