[发明专利]用于检测产气荚膜梭菌的荧光定量PCR方法及相应的试剂盒

说明书

本发明公开了一种用于检测产气荚膜梭菌的荧光定量PCR方法及相应的试剂盒。本发明巧妙的应用了特异性的基因检测区分产气荚膜梭菌与其它梭菌，通过判断，得出准确的菌信息。本发明与现有的主流检测试剂盒相比，本发明用于检测产气荚膜梭菌的试剂盒具有灵敏度高、快捷方便、特异型好、判断严谨准确等优势，具有良好的应用前景和市场价值。

技术领域

本发明属于分子检测技术领域，具体涉及一种通过特异性基因对产气荚膜梭菌进行荧光定量PCR检测的方法和相应的检测试剂盒。

背景技术

产气荚膜梭菌(Clostridium perfringens)是临床上气性坏疽病原菌中最多见的一种梭菌，因能分解肌肉和结缔组织中的糖，产生大量气体，导致组织严重气肿，继而影响血液供应，造成组织大面积坏死，加之本菌在体内能形成荚膜，故名产气夹膜梭菌。

产气荚膜梭菌为革兰阳菌粗短大杆菌。芽胞呈椭圆形，位于菌体中央或次极端，芽胞直径不大于菌体，在机体内可产生明显的荚膜，无鞭毛，不能运动。生长适宜温度为37-47℃，在普通培养基上能生长，若加葡萄糖，血液，则生长更好。在庖肉培养基中培养数小时即可见到生长，产生大量气体，肉渣或肉块变为略带粉色。

致病条件与全国各地破伤风梭菌相似。产气荚膜梭菌既能产生强烈的外毒素，又有多种侵袭性酶，并有荚膜，构成其强大的侵袭力，引起感染致病。毒素的毒性虽不如肉毒毒素和破伤风毒素强，但种类多，外毒素有α、β、γ、δ、ε、η、θ、ι、κ、λ、μ、ν等12种，对人致病的主要是a型，引起气性坏疽和食物中毒。C型则引起坏死性肠炎。

食品中产气荚膜梭菌的检测，最常使用的还是参照GB 4789.13-2012《食品安全国家标准食品微生物学检验产气荚膜梭菌检验》，进行样品制备，培养及试验。近年来，分子生物学技术以其高灵敏度、高特异性、实验周期短、易操作等优势逐步应用产气荚膜梭菌的检测，此项目乃开发国产基因芯片针对产气荚膜梭菌做高效且高精准度的检测。

发明内容

本发明的目的之一是提供一种用于检测产气荚膜梭菌的荧光定量PCR方法。

具体地，上述方法包括如下步骤：

S1、收集样品；

S2、提取基因组DNA；

S3、检测产气荚膜梭菌特异性基因gene1、gene2、gene3、gene4和rpoB；

S4、读取扩增Ct值；当所述产气荚膜梭菌特异性基因gene1、gene2、gene3、gene4和rpoB中至少1个基因的Ct值均小于35时，产气荚膜梭菌的检测结果为阳性；当所述荚膜梭菌特异性基因gene1、gene2、gene3、gene4和rpoB的Ct值大于35时，产气荚膜梭菌的检测结果为阴性。

作为一种优选技术方案，所述产气荚膜梭菌特异性基因gene1(NCBI AccessionNumber：BAB81852.1)的检测引物如SEQ ID NO:1～2所示：

SEQ ID NO:1(5'-TGGGGTAATTGTTGTGGCACT-3')；

SEQ ID NO:2(5'-TGTCCACCTACACTTTCAGCC-3')。

所述产气荚膜梭菌特异性基因gene2(NCBI Accession Number：AXH51720.1)的检测引物如SEQ ID NO:3～4所示：

SEQ ID NO:3(5'-AATAAACTTTGGTGGGAACGGAC-3')；

SEQ ID NO:4(5'-TTTCCACTACAACCGCCACC-3')；