[发明专利]用于检测产毒猪链球菌的荧光定量PCR方法及相应的试剂盒

说明书

本发明公开了一种用于检测产毒猪链球菌的荧光定量PCR方法及相应的试剂盒。本发明巧妙的应用了特异性的基因检测区分猪链球菌与其它链球菌属，以及产毒和非产毒的链球菌属，通过综合判断，得出准确的菌属信息。本发明与现有的主流检测试剂盒相比，本发明用于检测产毒猪链球菌的试剂盒具有灵敏度高、快捷方便、特异型好、判断严谨准确等优势，具有良好的应用前景和市场价值。

技术领域

本发明属于分子检测技术领域，具体涉及一种通过特异性基因对产毒猪链球菌进行荧光定量PCR检测的方法和相应的检测试剂盒。

背景技术

猪链球菌(Streptococcus suis)是一种具有荚膜的革兰氏阳性球菌。在血平板培养基上生长，菌落周围形成溶血环。猪链球菌可根据其细胞壁抗原成分将其归类为兰氏分群D群链球菌。

猪链球菌是一种人畜共患病原菌，根据其荚膜抗原(CPS)的不同，猪链球菌被分为35(1～34型、1/2型)种血清型，其中1、2、7、9型是致病力最强的猪链球菌。猪链球菌的致病因子有荚膜多糖、溶菌酶释放蛋白、细胞外因子、溶血素。猪链球菌血清型和毒力因子表型的分布具有地区性差异。

部分血清型的猪链球菌具有致病性，主要通过伤口感染。猪链球菌的自然感染部位是猪的上呼吸道(特别是扁桃体和鼻腔)、生殖道和消化道。猪在各种动物中易感性较高。各种年龄的猪均可发病，可引起猪的急性败血症、脑膜炎、关节炎、心内膜炎、肺炎等疾病。在人的感染中，猪链球菌可经飞沫或伤口触碰而感染人类，引起败血症、链球菌感染中毒休克症和知觉性耳聋等病症。病菌会入侵脑膜，使患者出现发烧、神志不清和昏迷等病征。病菌进入血液，会出现败血症，引起皮下出血及急性器官衰竭。

目前，国内外对猪链球菌进行了大量研究，建立了很多有效的检测方法，其中细菌纯培养、生理生化检测、血清学分型及噬菌体分型已广泛应用，但仍然存在耗时、灵敏度低等问题。近年来，随着高通量基因组测序技术广泛应用，越来越多的猪链球菌菌株得到了全基因组测序，为分子诊断技术锁定猪链球菌特异序列提供了参考数据库。当前，分子生物学技术正以其高灵敏度、高特异性、实验周期短、易操作等优势逐步应用于猪链球菌的诊断检测。

发明内容

本发明的目的之一是提供一种用于检测产毒猪链球菌的荧光定量PCR方法。

具体地，上述方法包括如下步骤：

S1、收集样品；

S2、提取基因组DNA；

S3、检测猪链球菌属特异性基因rpoB以及产毒特异性基因gene1、gene2、gene3和gene4；

S4、读取扩增Ct值；当所述猪链球菌属特异性基因和所述产毒特异性基因中至少1个基因的Ct值均小于35时，产毒猪链球菌的检测结果为阳性；当所述猪链球菌属特异性基因rpoB的Ct值大于35和/或所述产毒特异性基因gene1、gene2、gene3和gene4的Ct值大于35时，产毒猪链球菌的检测结果为阴性。

作为一种优选技术方案，所述猪链球菌属特异性基因rpoB(NCBI AccessionNumber：DQ232478.1)的检测引物如SEQ ID NO:1～2所示；

SEQ ID NO:1(5'-ACAACTTCGAGGATGCGGTT-3')；

SEQ ID NO:2(5'-CCCATTTCGTCCAAGTTGCG-3')。

所述产毒特异性基因gene1(NCBI Accession Number：ADE32332.1)的检测引物如SEQ ID NO:3～4所示；

SEQ ID NO:3(5'-ATGCAGGGCCGAGAAACTC-3')；

SEQ ID NO:4(5'-ACCAATCACCCCAACGTCAT-3')。