[发明专利]非洲猪瘟病毒VP72和CD2V基因的双重实时荧光检测引物探针组、试剂盒及方法

说明书

本发明属于分子生物学技术领域，公开了一种非洲猪瘟病毒VP72基因及CD2V基因荧光检测引物探针组、试剂盒及方法。本发明的引物探针组针对VP72基因，正向引物核苷酸序列如SEQ ID NO.1，反向引物核苷酸序列如SEQ ID No.2所示，特异性荧光探针核苷酸序列如SEQ ID No.3所示，针对CD2V基因，正向引物核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示，反向引物核苷酸序列如SEQ ID No.11所示，特异性荧光探针核苷酸序列如SEQ ID No.12，其中，所述特异性荧光探针的5’端标记有荧光报告基团，3’端标记有荧光淬灭基团。本发明在一次扩增反应中同时检测两种基因，实现了对非洲猪瘟病毒的野毒株和CD2V基因缺失疫苗株进行简便、快捷、准确、特异性检测的目的。

技术领域

本发明属于分子生物学技术领域，具体涉及一种非洲猪病病毒VP72和CD2V基因的双重实时荧光检测引物探针组、试剂盒及检测方法。

背景技术

非洲猪瘟(African Swine Fever,ASF)是一种高发病性、高死亡性的急性猪传染病，对猪和猪产品国际贸易产生巨大卫生和社会经济影响。ASF的流行病学非常复杂，可以经过许多途径传播，如饲料、运输、虫媒等等。该病的致病因子ASF病毒(ASFV)，是非洲猪瘟病毒科家族的唯一成员，属Asfivirus。它是一种复杂的包膜病毒，具有二十面体形态，由四个同心层和一个大的双链DNA分子组成，长度在170至193kbp之间。

疫苗接种是传染病的最佳控制措施之一。目前在非洲猪瘟疫苗的研究中主要集中在灭活疫苗、弱毒疫苗、病毒活载体疫苗、核酸疫苗等。灭活疫苗指运用物理或化学方法去除病原活性，感染能力丧失，但仍具有抗原性。到目前为止，运用多种传统方法制备的ASF灭活疫苗都不能对猪提供有效的免疫保护。弱毒疫苗以不同的毒株来源分为三种：天然致弱病毒株、传代致弱毒株以及重组致弱毒株。大量实验结果表明：天然弱毒株及传代弱毒株在生物安全方面仍存在问题。目前在我国研究者根据非洲猪瘟病毒在中国的流行株的基因型别，开发了一系列的重组弱毒株疫苗，通过生物技术方法，将ASFV中的某个或某几个基因进行敲出，制备出基因缺失疫苗，其中CD2V基因缺失疫苗是研究最多的一种基因缺失ASFV疫苗。

由于目前市场上使用CD2V缺失疫苗的研究数据还不充分，具体其的免疫效果仍待进一步的研究，在其疫苗使用过程中就需要对ASFV野毒株和CD2V基因缺失的疫苗株进行区分鉴定，对使用疫苗的有非洲猪瘟症状的猪群的感染源进行正确的鉴别。

发明内容

基于上述背景介绍，本发明的目的是提供一种非洲猪病病毒VP72和CD2V基因的双重实时荧光检测引物探针组、试剂盒及检测方法。

本发明利用双重实时荧光PCR方法，以非洲猪瘟病毒的VP72基因和CD2V基因作为靶基因，当检测结果显示VP72基因和CD2V基因同时是阳性时，说明被检测样本中含有非洲猪瘟野毒株；单检测结果显示VP72基因为阳性而CD2V基因为阴性时，说明检测样本中为非洲猪瘟CD2V基因缺失的疫苗株；当VP72基因和CD2V基因都为阴性时，说明检测样本中不含非洲猪瘟病毒。优化设计引物、探针和反应条件，使得在一次扩增反应中同时检测两种基因，对非洲猪瘟病毒的野毒株和CD2V基因缺失疫苗株进行特异性检测，达到简便、快捷、准确可靠和安全的目的，防止假阳性结果。

作为本发明的第一方面，本发明提供一种非洲猪病病毒VP72和CD2V基因的双重实时荧光检测引物探针组。

作为优选，所述引物探针组中，针对VP72基因，正向引物核苷酸序列如SEQ IDNO.1所示，反向引物核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，特异性荧光探针核苷酸序列如SEQ IDNO.3所示；针对CD2V基因，正向引物核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示，反向引物核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示，特异性荧光探针核苷酸序列如SEQ ID NO.12所示，其中，所述特异性荧光探针的5’端标记有荧光报告基团，3’端标记有荧光淬灭基团。