[发明专利]一种定量检测紧密连接相关蛋白Occludin的ELISA试剂盒

权利要求书

1.一种定量检测紧密连接相关蛋白Occludin的ELISA试剂盒，其特征在于：所述试剂盒包括包被Occludin包被抗体的酶标板、HRP标记的羊抗兔IgG、兔抗人Occludin多克隆抗体、洗涤液、样品稀释液、显色剂、终止液、质控品和标准品，所述试剂盒以Occludin包被抗体和羊抗兔IgG为基础，以双抗体夹心法建立Occludin蛋白检测的ELISA方法。

2.根据权利要求1所述的一种定量检测紧密连接相关蛋白Occludin的ELISA试剂盒，其特征在于：所述Occludin包被抗体的浓度为10ng/L，所述兔抗人Occludin多克隆抗体的浓度为15ng/L，所述羊抗兔IgG的浓度为1ng/L。

3.根据权利要求1所述的一种定量检测紧密连接相关蛋白Occludin的ELISA试剂盒，其特征在于：所述质控品和校准品来自于人体血清，所述质控品的浓度为100ng/L，所述校准品的浓度梯度为120±12ng/L、80±8ng/L、40±4ng/L、20±2ng/L、10±1ng/L、0ng/L，校准品或质控品的缓冲液为含有0.1mol/L的PB、0.15mol/L的氯化钠、1％的牛血清白蛋白及0.05％tween-20、pH值为6.5的缓冲液。

4.根据权利要求1所述的一种定量检测紧密连接相关蛋白Occludin的ELISA试剂盒，其特征在于：所述显色剂包括显色剂A和显色剂B，所述显色剂A为10g/L的过氧化脲素溶液，所述显色剂B为2g/L的TMB·2HCl溶液，显色液使用时取等体积的A、B液混匀。

5.根据权利要求1所述的一种定量检测紧密连接相关蛋白Occludin的ELISA试剂盒，其特征在于：所述洗涤液为25倍浓缩的磷酸缓冲液，所述终止液为2M H₂SO₄溶液。

6.根据权利要求1所述的一种定量检测紧密连接相关蛋白Occludin的ELISA试剂盒，其特征在于：所述试剂盒的检测对象为血清、细胞上清、血浆或组织。

7.根据权利要求1所述试剂盒在Occludin蛋白定量检测中的应用，其特征在于，通过以下步骤实现：

1)加样：先加入50ul待测样本/Occludin校准品/Occludin质控品，再加入50ulOccludin结合抗体于相应孔中，轻拍混匀，设空白孔；

2)温育：用封口膜将条板封好，37℃温育30分钟；

3)洗板：取出反应板，甩尽板中液体，每孔注满洗涤液洗板5次，拍干，在洗涤过程中应避免产生气泡；

4)加酶：每孔加入两滴或100ul的GR酶结合物，空白孔不加；

5)温育：用封口膜将条板封好，37℃温育30分钟；

6)洗板：取出反应板，甩尽板中液体，每孔注满洗涤液洗板5次，拍干，在洗涤过程中应避免产生气泡；

7)显色：每孔加入显色剂A、B溶液各一滴或各50ul，充分混匀，置37℃温育15分钟；

8)终止：每孔尽快加入终止液1滴轻拍混匀；

9)测定：用酶标仪以空白对照调零，测定各孔OD.值；

10)结果计算：以校准品浓度作横坐标，OD.值作纵坐标，以双对数拟合绘制校准曲线。通过待测样本的OD.值可在校准曲线上查出其对应浓度值。