[发明专利]葡萄糖氧化酶冻干粉的制备方法

说明书

本发明属于酶制剂的制备，特别是指葡萄糖氧化酶冻干粉的制备方法。按照公开号CN107937360A中的方法制备含有葡萄糖氧化酶的发酵液；将含有葡萄糖氧化酶的发酵液高速离心去除发酵液中的菌体，将离心后上清液用无水乙醇纯化后用磷酸盐缓冲液稀释至所需酶活；加入PEG2000作为冻干保护剂使其充分溶解并在酶液中分布均匀；预冻后置于真空冷冻干燥剂内冷冻干燥得到淡黄色葡萄糖氧化酶冻干粉。本发明解决了目前葡萄糖氧化酶直接进行冷冻干燥导致的酶活回收率低的问题，具有葡萄糖氧化酶冻干粉酶活回收率高、易于保存和运输、为葡萄糖氧化酶应用于生物医药、饲料及食品加工等领域提供了便利等优点。

技术领域

本发明属于酶制剂的制备，特别是指葡萄糖氧化酶冻干粉的制备方法。

背景技术

葡萄糖氧化酶应用范围广泛，在医药行业中，葡萄糖氧化酶由于对β-D-葡萄糖具有严格的底物专一性，因此通常将葡萄糖氧化酶制备成试纸或试剂盒，用于检测血糖浓度，诊断糖尿病。饲料行业中，该酶作为饲料添加剂，有利于动物的营养吸收，减少腹泻率。葡萄糖氧化酶还可作为食品添加剂用于食品保鲜，对果酒护色也有一定效果。

真空冷冻干燥技术，简称为冻干技术，广泛应用于食品、医药、生物等各个领域，是将样品预先冻成固体，然后在低温低压的条件下，从冻结状态不经过液态而直接升华除去水分的一种干燥方法。葡萄糖氧化酶干粉制剂在生物医药领域具有非常广泛的应用前景，但是目前国内企业葡萄糖氧化酶制剂产品与国外企业相比仍有很大差距。葡萄糖氧化酶作为一种蛋白质，遇高温易导致失活变性，冻干技术的操作过程均处于低温状态，更适用于其干粉制剂的制备。由于冻干是一个复杂的相变过程，在冻结、冻融、干燥和储存过程中，存在多种诱导酶变性的因素，因此需在冻干过程中添加保护剂。加入的冻干保护剂能够取代水与蛋白结合，使蛋白的结构免遭破坏，保证了葡萄糖氧化酶的稳定性。葡萄糖氧化酶经过冷冻干燥后不易变质、可长期储存，易复水再生，有利于活性的保持。真空冷冻干燥方法制备葡萄糖氧化酶制剂与喷雾干燥相比回收率高，但相关技术还不够完善，葡萄糖氧化酶直接进行冷冻干燥，酶活回收率仅能达70％左右，因此选择合适的葡萄糖氧化酶冻干保护剂至关重要。

在医药行业中，生物技术产品常用的剂型为固态，因此葡萄糖氧化酶作为关键酶常以固体的形式被制成血糖试纸或诊断试剂盒来使用。在其他应用行业中，固态葡萄糖氧化酶相比液态更有利于运输和保存，使用更为便利。

申请人检索的背景文献情况如下：

公开号为CN1060026A的专利文献中公开了一种葡萄糖氧化酶冷干粉制造工艺，该专利的目的是采用新的纯化工艺对葡萄糖氧化酶进行冻干，并未提及使用何种保护剂及添加量；公开号为CN101481680A的专利文献中公开了一种葡萄糖氧化酶生产方法，该专利利用青霉菌制备葡萄糖氧化酶发酵液，经纯化脱盐后冻干制成固体制剂，但该专利也未提及使用何种保护剂以及添加剂量；公开号为CN109825483A的专利文献中公开了一种高产葡萄糖氧化酶生产工艺，该专利利用发酵毕赤酵母生产制备出液体发酵液，再经过喷雾干燥制得葡萄糖氧化酶粉末，未提及使用冻干的方法制备葡萄糖氧化酶干粉。

《点青霉葡萄糖氧化酶基因的克隆及其酶学性质研究》(生物技术通报2016，32(7):152-159)中公开了克隆点青霉菌(Penici l l ium notatum)中的葡萄糖氧化酶基因(GOD)，在毕赤酵母(Phchia pastoris)中异源表达，纯化并研究其酶学性质。利用PCR技术从点青霉No.8312菌株的基因组DNA中克隆得到GOD基因，将该基因克隆到穿梭载体pMD-AOX上并在毕赤酵母X33中表达，对纯化后的葡萄糖氧化酶的酶学性质进行分析。结果显示，X33-GOD可高表达具有活性的GOD，在30℃、pH＝6.5的条件下，其培养液上清GOD酶活可达496U/mL，比活123.0U/mg；重组表达的葡萄糖氧化酶最适温度为40-45℃，最适pH＝6.0，酶的稳定性研究表明，该酶在pH3.5-7.0区间和温度低于50℃下稳定。1mmol/L Zn2+对其有激活作用；Ag+对该酶活性有较大抑制作用。构建出GOD的高产毕赤酵母工程菌株，与点青霉GOD相比具有更高的发酵酶活和比活。