[发明专利]一段分离的核苷酸序列在肌间刺减少的斑马鱼构建中的应用

说明书

本发明属于分子生物学领域，公开了一段分离的核苷酸序列在肌间刺减少的斑马鱼构建中的应用，所述的核苷酸序列为SEQ ID NO.1所示，利用本领域的常规方法，以SEQ ID NO.1为靶基因进行基因突变操作，筛选出发生突变的F0，对F0与野生型杂交产生的F1进行基因分型，筛选出突变体F1并自交，即可获得肌间刺数目显著减少70%以上且稳定遗传的斑马鱼少肌间刺品系。本发明利用一段分离的核苷酸序列首次获得了肌间刺减少的鱼类品系，且具有性状改良效果显著、育种时间短、遗传稳定、成本低等优点，具有科学研究的基础价值和应用价值，不仅能用于鱼类肌间刺发育机制研究，而且为获得多种鱼类少肌间刺的稳定遗传品系提供了方法。

技术领域

本发明属于分子生物学领域，具体涉及一段分离的核苷酸序列在肌间刺减少的斑马鱼构建中的应用，通过对该核苷酸序列进行突变，可减少斑马鱼肌间刺，同时获得可稳定遗传的减少了肌间刺的斑马鱼突变体。

背景技术

肌间刺(Intermuscular bone)是仅存在于低等真骨鱼类肌肉中的针状骨骼，是由肌膈结缔组织连续同源骨化而来的膜骨(Patterson and Johnson,1995；Danos and Ward,2012)。全世界主要养殖鱼类中，几乎一半属于鲤形目(Cypriniformes)，这些鱼类都具有一定数量的肌间刺，如鲫鱼(Carassiuscarassius)、草鱼(Ctenopharyngodonidella)、鲢(Hypophthalmicht hys molitrix)等。有肌间刺的鲤科鱼类贡献了约70％的鱼类水产养殖总产量以及56％的总产值(Nie et al.,2019)，但肌间刺的存在对其经济与食用价值都造成了不利的影响(KnightLesser 1989；Lin et al.,2014)。自然缺失全部肌间刺的大盖巨脂鲤个体与同种含肌间刺个体无其它性状差别(Perazza et al.,2017)，表明了肌间刺数量性状选育的可行性。已有研究也对肌间刺发生发育及数目相关的分子遗传信息进行了发掘(Wan et al.,2016；Nie et al.,2017；Wan et al.,2017；Nie et al.,2018；Wan etal.,2019)，提供了肌间刺研究的遗传数据基础，但之前未筛选出与肌间刺数目直接相关的基因信息。

斑马鱼(Danio rerio)体型小巧、易于饲养、发育周期短且繁殖能力强，是重要的脊椎动物实验模型。目前，基因编辑、转基因、分子诱导等实验技术已成功在斑马鱼模型中获得应用，研究人员通过这些实验手段发现并且证明了数以千计的基因功能(彭伟等，2019)。随着骨骼研究方法和技术日益完善，斑马鱼也已经成为鱼类和脊椎动物骨骼研究的理想模型，具有广阔的科研和商业前景。已有研究对斑马鱼肌间刺的类型，分布及发育进行了观察，结果表明斑马鱼肌间刺的形态学与发育学特征与鲤科含刺鱼类基本一致(聂春红等，2018)。鉴于斑马鱼全基因组数据完善(http://asia.ensembl.org/Danio_rerio/Info/Index)，产卵量大且易收集，胚胎成活率高(黄桂才等，2017)，DNA显微注射技术成熟(陶大昌等，2012)等特点，可以选择模式斑马鱼进行肌间刺数目性状相关基因的筛选与功能验证。

Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats(CRISPR)/CRISPR-associated(Cas9)是2013年初出现的新一代基因编辑技术。它主要是基于细菌的一种获得性免疫系统人工改造而成，具有制作简单、使用方便、成本低、作用效率高等特点(MussolinoCathomen,2013)。CRISPR/Cas9技术自发现至今，已被证实能在不同物种广泛使用，包括哺乳动物、微生物和植物，如人(Homo sapiens)(Liang et al.,2015)、小鼠(Musmusculus)(Coppola et al.,2015)、果蝇(Drosophila melanogaster)(PortBullock,2016)、斑马鱼(Xie et al.,2016)等。CRISPR/Cas9基因编辑技术为筛选鱼类肌间刺发生发育关键调控基因以及培育少或无肌间刺的鱼类新品系提供了高效的途径。

发明内容