[发明专利]基于咖啡环效应的甲壳类精氨酸激酶检测试剂盒及其检测方法

说明书

本发明公开了一种基于咖啡环效应的甲壳类精氨酸激酶检测试剂盒及其检测方法。基于咖啡环效应的甲壳类精氨酸激酶检测试剂盒，其特征在于：包括纳米金颗粒、核酸探针、甲壳类精氨酸激酶，所述核酸探针为甲壳类精氨酸激酶核酸适配体；所述精氨酸酶核酸适配体。本发明的试剂盒，将核酸探针与纳米金颗粒通过Au‑S键紧密连接，利用核酸适配体和蛋白质的空间结构互补作用，使得纳米金‑核酸适配体探针可特异性识别甲壳类精氨酸激酶。通过蛋白与纳米金之间的作用力，影响纳米金的咖啡环效应，具有良好的特异性、灵敏度和亲和力，可特异性结合甲壳类精氨酸激酶，可用于定量、定性确定食品中甲壳类过敏原的含量。

技术领域

本发明涉及过敏原检测领域，具体涉及一种基于咖啡环效应的甲壳类精氨酸激酶检测试剂盒。

背景技术

近年来，有关食源性虾、蟹过敏的报道屡见不鲜。据统计，在亚洲国家中，大约有40％的成人和儿童会对甲壳类产生过敏反应。目前，美国、欧盟和新西兰等国家均要求对过敏食品进行过敏原标示，以提醒消费者，避免误食。因此，过敏原含量的检测是进行过敏食品的生产、评估和标示工作的基础和首要任务。精氨酸激酶(Arginine Kinase，AK)广泛存在于虾、蟹等甲壳类中，是甲壳类中的主要过敏原。甲壳类精氨酸激酶检测方法主要有ELISA、RT-PCR、LC-MS等技术。这些方法都需要高端仪器设备及专业人员操作，检测时间较长，操作较为复杂。由此，甲壳类过敏原的检测方法有待改进。

“咖啡环效应”是指液滴蒸发时，溶质会在边缘沉积出一个颜色较深的环状沉积渍的现象。该现象普遍存在于胶体颗粒、纳米颗粒及小分子体系之中。大量研究表明，通过控制液滴的“咖啡环效应”，改变其最终形成的环状沉积渍的形态或边缘厚度，可成功实现多种待检目标物的鉴定及定量检测，在诊断分析、生物传感技术等领域有着巨大的应用前景。比如，Devineau等人的研究结果显示，蛋白质的存在对聚苯乙烯纳米颗粒的咖啡环效应有着显著的影响。即，不同蛋白质与聚苯乙烯纳米颗粒之间静电相互作用力显著不同，最终影响聚苯乙烯颗粒在基底表面形成的沉积渍的形态，实现对镰状细胞性贫血患者血红蛋白快速直观的识别与鉴定。由此可见，利用目标物与纳米颗粒间相互作用力对“咖啡环效应”的独特影响，可有效实现目标物的快速、直观检测。

发明内容

本发明的目的是提供一种基于咖啡环效应的甲壳类精氨酸激酶检测试剂盒，解决如何提供一种检测盒进行检测的技术问题。

本发明的另一个目的是提供一种基于咖啡环效应的甲壳类精氨酸激酶检测方法。该方法具有高特异性、高灵敏度、成本低廉、易于保存等优点，其制成的甲壳类精氨酸激酶检测试剂盒，可用于定量检测甲壳类精氨酸激酶。

基于咖啡环效应的甲壳类精氨酸激酶检测试剂盒，其特征在于：包括纳米金颗粒、核酸探针、甲壳类精氨酸激酶，所述核酸探针为甲壳类精氨酸激酶核酸适配体；所述精氨酸酶核酸适配体，其具有SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列，序列为：

5’-SH-C6-TTTTTTTTTTGGCGAACAGCAGCGCGATTCGGGTTGCGGATAGTGACATA-3’；所述的纳米金颗粒的粒径为10～13nm。

所述精氨酸酶核酸适配体的5’端经巯基修饰。

基于咖啡环效应的甲壳类精氨酸激酶检测方法，包括以下操作步骤：

a、将核酸探针与纳米金颗粒通过Au-S键紧密连接，形成纳米金-核酸适配体探针；所述纳米金与核酸探针摩尔质量之比为1:400～1:450；核酸探针的浓度为0.1～0.15mM；

b、配制一系列浓度梯度的甲壳类精氨酸激酶标准溶液，分别与步骤(1)制备的纳米金-核酸探针等体积混合均匀，进行孵育，将孵育后的混合液滴到玻璃载玻片上，静置蒸发；所述精氨酸激酶浓度为15～100μg/mL；所述精氨酸激酶与纳米金-核酸适配体探针的孵育时间为1～1.5h；

c、光学显微镜下观察干燥后的液滴环，记录其边缘厚度。