[发明专利]一种胚胎分泌蛋白的检测方法

权利要求书

1.一种胚胎分泌蛋白的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：

a、取待测胚胎分泌蛋白的捕获抗体和标记抗体，将所述捕获抗体连接在荧光磁珠上，将所述标记抗体用生物素标记；

b、将步骤a中的所述荧光磁珠与待测胚胎分泌蛋白混合并孵育，接着将所述荧光磁珠取出清洗3～5遍，将清洗后的所述荧光磁珠、步骤a得到的用生物素标记的所述标记抗体以及联袂亲和素标记的β-半乳糖苷酶混合后，孵育，然后将所述荧光磁珠取出清洗3～5遍，再用PBS缓冲液重悬所述荧光磁珠；

c、将步骤b得到的重悬后的所述荧光磁珠置于微流控芯片的第一样品孔中，将荧光底物置于第二样品孔中，将液滴生成油置于油相进样孔中，通过注射器将所述荧光磁珠免疫复合物和荧光底物以及所述液滴生成油按照1:1:5的流速比注入微流控芯片形成油包水液滴，将生成的油包水液滴用毛细管进行收集，收集完成后将毛细管两端封闭，进行孵育；

d、将步骤c中得到的孵育完成的毛细管中的油包水液滴导入检测芯片，在鞘流的作用下，当油包水液滴经过检测窗口时，多色激光诱导荧光检测器检测得到荧光磁珠荧光信号和荧光底物酶促产物荧光信号，根据计算公式得到平均每个磁珠上所连酶的数量，具体计算公式如下：

AEB＝-ln(1-f)

其中：f为n/N；

N为检测到的荧光磁珠信号为阳性的油包水液滴数量，单位为个；

n为荧光磁珠荧光信号和荧光底物酶促产物荧光信号均为阳性的油包水液滴数量，单位为个；

AEB为平均每个磁珠上连接酶的数量，单位为个；

以AEB为纵坐标，单位为pg/mL的浓度为横坐标绘制标准曲线，根据标准曲线计算待测胚胎分泌蛋白浓度。

2.根据权利要求1所述的胚胎分泌蛋白的检测方法，其特征在于，在步骤a中，所述荧光磁珠的直径为5～10um，所述荧光磁珠表面的功能基团为羧基或N-羟基琥珀酰亚胺。

3.根据权利要求1所述的胚胎分泌蛋白的检测方法，其特征在于，在步骤b中，所述孵育的温度均为37℃，所述孵育的时间均为25～35min；所述清洗均采用纯水；所述PBS缓冲液的体积为5～20uL。

4.根据权利要求3所述的胚胎分泌蛋白的检测方法，其特征在于，所述孵育的时间均为30min；所述PBS缓冲液的体积为10uL。

5.根据权利要求1所述的胚胎分泌蛋白的检测方法，其特征在于，在步骤c中，所述荧光底物为荧光素2-β-D-吡喃半乳糖苷或试卤灵-2-β-D-吡喃半乳糖苷。

6.根据权利要求5所述的胚胎分泌蛋白的检测方法，其特征在于，当荧光底物为荧光素2-β-D-吡喃半乳糖苷时，在步骤d中，所述多色激光诱导荧光检测器的激发波长为488nm，荧光收集波段为525nm；

当荧光底物为试卤灵-2-β-D-吡喃半乳糖苷时，在步骤d中，所述多色激光诱导荧光检测器的激发波长为558nm，荧光收集波段为580nm。

7.根据权利要求1所述的胚胎分泌蛋白的检测方法，其特征在于，在步骤c中，所述液滴生成油为氟油、矿物油和石蜡油中的任意一种，所述孵育的温度为37℃，所述孵育的时间为1-3h。

8.根据权利要求1所述的胚胎分泌蛋白的检测方法，其特征在于，在步骤d中，阳性信号为荧光素检测通道的信号＞0.2V且相应的荧光磁珠检测信号＞1V。