[发明专利]一种检测假丁酸弧菌的引物组及其检测体系和应用

说明书

本发明提供了一种检测假丁酸弧菌的引物组及其检测体系和应用；所述引物组合物为针对肠道细菌的16S rRNA设计的特异性引物，所述特异性引物包括随机碱基，所述随机碱基的个数为3‑5个。基于引物组摸索验证检测体系，各步骤各条件相互配合，协同增持，使其检测结果稳定准确，检测步骤简洁高效，具有广阔的应用前景和巨大的市场价值。

技术领域

本发明属于生物领域，涉及一种检测假丁酸弧菌属的引物组及其检测体系和应用。

背景技术

结直肠癌是常见的胃肠道恶性肿瘤，早期症状不明显，随着癌肿的增大而表现排便习惯改变、便血、腹泻、腹泻与便秘交替、局部腹痛等症状，晚期则表现贫血、体重减轻等全身症状。其发病率和病死率在消化系统恶性肿瘤中仅次于胃癌、食管癌和原发性肝癌。结直肠癌也是目前最可预防的肿瘤之一，医学界认为如果及早发现，肠癌是最易治愈的癌症。

传统的结直肠癌筛选方法主要是结肠镜检查，另外还有活体组织检查和脱落细胞学检查，这几种检查方法都是侵入式的，尤其是脱落细胞学检查取材繁琐，不易获得满意的标本，临床应用少。所以如果没有相关症状，很多人并不愿意去做结直肠癌的早期筛查。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明提供了一种通过检测假丁酸弧菌属评估结直肠癌发病率的方法，本发明包含了假丁酸弧菌属的特异性引物，通过添加随机碱基的方法，提高引物组合物与微生物组合的特异性和准确性。

为达到此目的，本发明采用以下技术方案：

第一方面，假丁酸弧菌引物组设计，本发明提供了一种鉴定肠道假丁酸弧菌的引物组，所述引物组为针对肠道细菌16S rRNA设计的特异性引物，所述特异性引物包括随机碱基3-5个。通过加入随机碱基，调控随机碱基的数量，提高检测特异性。

经过对大量正常人和结直肠癌患者粪便样本的测序分析显示，假丁酸弧菌属与结直肠癌显著相关，因此将假丁酸弧菌作为检测菌种。

微生物16S rRNA序列包含9个可变区和10个高度保守区，为保证引物特异性，选择在保守区内设计引物，另外相对于其他可变区，V3-V4区可覆盖98%以上的细菌，且V3-V4区扩增产物长度符合qPCR对引物预期产物长度的要求。根据这个条件，可以设计一对鉴定粪便样本中所有微生物总量的引物。

优选地，所述引物组包括假丁酸弧菌引物和总菌引物。

优选地，所述引物长度为18-25bp，例如可以是18bp、19bp、20bp、21bp、22bp、23bp、24bp、或25bp。

本发明中，发明人设计引物组并验证其特异性，比对出的序列均为细菌16S rRNA序列或全基因组序列。用引物通过PCR扩增出目的片段，然后进行电泳，产物条带与预期一致，且无任何杂带，对引物扩增出的片段进行一代测序，将测序所得序列在NCBI网站上Nμcleotide BLAST（https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）功能进行序列比对，与预期产物序列相似度高于90%。

确定的假丁酸弧菌引物对为：SEQ ID NO.1-4，总菌引物为：SEQ ID NO.5-8.

确定条件：1）扩增产物单一且大小与预期一致；2）扩增产物测序结果与预期产物序列相似度高；3）融解曲线峰形为单峰且集中；4）扩增效率在90%-105%之间。

第二方面，本发明提供一种检测体系，所述检测体系包含第一方面所述的引物组，以及DNA、qPCR SYBRGreen Mix和dd ddH₂O。