[发明专利]一种获取木本植物维管形成层的方法及其应用

说明书

本发明提供了一种获取木本植物维管形成层的方法及其应用，所述的方法将含有维管形成层的木本植物组织石蜡切片用激光显微切割方法获取其中的维管形成层。本发明通过石蜡切片和激光显微切割技术的有机结合，成功分离得到木本植物黄梁木的纯的形成层组织。本发明优化了石蜡切片流程，调试LMD参数，建立了黄梁木实生苗维管组织细胞的激光显微切割技术体系，获得了高质量的维管形成层。本发明公开的方法在木本植物同类组织中应用未见报道，该方法获得的组织器官细胞同质性较高，细胞结构完整，为进一步研究形成层的分子生物学及基因组学研究奠定基础。

技术领域

本发明属于生物技术领域，特别涉及一种获取木本植物维管形成层的方法及其应用。

背景技术

木材的径向生长是维管形成层向内分化为次生木质部和向外分化为次生韧皮部的结果，维管形成层对于木本植物的生长至关重要，它是林木区别于其他一年生或多年生草本植物的主要组织，形成层活性导致了茎的增厚，并且伴随着生物量的增加。除此之外，维管形成层还能在植物的受伤部位形成愈伤组织从而进行自我保护，在恶劣的生长环境中休眠以避免细胞受到伤害。因此研究维管形成层基因表达特性和形成层细胞的分裂与分化的分子遗传机制，将为木本植物生物量遗传改良及抗性筛选奠定重要基础。但由于传统的方法很难将影响木材形成的关键活性组织区域形成层完整清晰地分离处理，人们对形成层的认识还相当有限。如何提高取材部位的准确性，是研究形成层区细胞分化分子机理的关键所在。

激光显微切割技术(Laser Microdissection，LMD)是一种从异质细胞群中分离目标细胞的有效技术。LMD常与冷冻切片和石蜡切片相结合，收获的细胞可以提取DNA、RNA和蛋白质，用于分析来自各种细胞类型的基因组特征、基因表达和蛋白质谱。冷冻切片由于制片流程简单，可减少RNA损失并提高质量，但冷冻切片难以稳定植物组织中的液泡细胞，以及冷冻、解冻引起的组织完整性的丧失，这使得靶细胞的鉴定变得困难(Nelson et al.,2006)。而石蜡切片能更好地保留细胞结构，与LMD结合广泛应用于草本植物细胞材料，如拟南芥胚胎表皮细胞，玉米籽粒早期胚乳细胞等(Sakai et al.,2018；Zhang et al.,2018)。基于LMD的植物组织RNA分离过程中的主要困难是由于细胞壁的存在，次生细胞壁的木质化，完全分化的细胞中存在大的液泡，以及存在大的细胞间隙(Nakazono et al.,2003；Jyske et al.,2015；)，使得LMD应用于木本植物植物细胞成为挑战，需要保持组织切片和细胞收获期间组织学完整性和稳定的细胞内容物非常困难。目前，LMD结合石蜡切片应用在木本植物的相关报道较少，主要还是木本植物的非木质化组织，例如柑橘珠心胚起始细胞，苹果芽分生组织等(贾慧慧，2016；Verma et al.,2019)。LMD结合石蜡切片应用于木本植物维管组织未见报道。

黄梁木(Neolamarckia cadamba)是热带亚热带地区广泛分布的茜草科团花属速生阔叶树种，不仅生长十分迅速而且材质致密，它也是胶合板工业、纸浆和纸张生产的最佳原材料之一。黄梁木因其快速增长而被世界林业大会于1972年称为“奇迹之树”，其快速生长依赖于维管形成层细胞高活性的发生与分裂，因此，解析黄梁木维管形成层细胞发生与分裂的分子调控机制对于促进热带亚热带阔叶树种的遗传改良与应用具有重要作用。然而，在木本植物中尤其是速生树种中如何获得高质量的维管形成层仍然是一道技术难题，对于木本植物维管形成层发生与细胞分裂的分子调控机制也是知之甚少。

发明内容

本发明的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种获取木本植物维管形成层的方法。

本发明的另一目的在于提供所述的获取木本植物维管形成层的方法的应用。

本发明的目的通过下述技术方案实现：

一种获取木本植物维管形成层的方法，将含有维管形成层的木本植物组织石蜡切片用激光显微切割方法获取其中的维管形成层。

所述的木本植物优选为黄粱木。