[发明专利]一种密码子优化的玉足海参α-淀粉酶基因及其重组表达载体与应用

说明书

本发明提供了一种密码子优化的玉足海参α‑淀粉酶基因及其重组表达载体与应用。在玉足海参α‑淀粉酶基因序列基础上，对该基因信号肽后的前20个氨基酸的密码子进行优化，该优化的玉足海参α‑淀粉酶基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。本发明优化的玉足海参淀粉酶基因序列所编码的氨基酸序列与原基因序列编码一致，但可以在原核表达系统(大肠杆菌BL21)中成功表达出具有α‑淀粉酶活性的蛋白。而未优化的α‑淀粉酶序列无法在原核表达系统中表达。

技术领域

本发明涉及基因改造与蛋白表达技术领域，具体涉及一种密码子优化的玉足海参ɑ-淀粉酶基因及其重组表达载体与应用。

背景技术

淀粉酶是一种水解酶，是目前发酵工业上应用最广泛的一类酶。淀粉酶一般作用于可溶性淀粉、直链淀粉和糖原等α-1,4-葡聚糖，水解其α-1,4-糖苷键。根据作用的方式，淀粉酶可分为α-淀粉酶和β-淀粉酶。α-淀粉酶能水解淀粉中的α-1,4-葡萄糖苷键，将淀粉切成长短不一的短链糊精和少量的低分子糖类，从而使淀粉糊的黏度迅速下降，起到降低稠度和“液化”的作用，从而提高动物肠道消化食物和吸收营养的能力。在鱼类研究中，α-淀粉酶被认为是鱼类幼体消化能力成熟的标志。在海参幼体发育前期，淀粉酶可作为一种饲料调节剂，提高海参的摄食和消化吸收效率。

玉足海参(Holothuria leucospilota)属于楯手目(Aspidochirotida)、海参科(Holothuriidae)、海参属(Holothuria)，在海洋生态修复方面起重要作用。基于玉足海参对推动我国热带海参资源恢复的积极作用，中国科学院南海海洋研究所相关课题组率先开展了玉足海参的人工育苗和养殖研究。为了提高海参的摄食和消化吸收效率，课题组试图通过原核表达的方法获得玉足海参α-淀粉酶。然而，玉足海参的α-淀粉酶基因无法在原核表达系统中成功表达，因此需要借助基因改造的方法来使玉足海参α-淀粉酶在原核表达系统中进行表达。

在众多的基因改造技术中，密码子优化技术是目前应用较广泛的技术。密码子优化是基于氨基酸具有密码子简并性的原理，通过改变基因序列中的一个或多个适合在原核表达系统中表达的密码子，而不改变原有的氨基酸序列，以确保表达的蛋白和内源分泌的蛋白具有相同的理化特性。

发明内容

本发明的目的是提供一种密码子优化的玉足海参α-淀粉酶基因及其重组表达载体与应用。通过密码子优化使玉足海参的α-淀粉酶基因在原核表达系统中成功表达出具有α-淀粉酶活性的蛋白，进而为人工养殖海参提供一种饲料调节剂，提高海参的摄食和消化吸收效率。

为实现上述发明目的，本发明以本课题组构建的玉足海参第二代转录组数据库中的α-淀粉酶基因的部分序列为基础，通过RACE技术获得该基因的全长序列，然后在NCBI数据库(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/)预测出其开放读码框(ORF)。结果显示该淀粉酶基因全长cDNA为1734bp，开放阅读框(ORF)为1578bp，编码525个氨基酸，预测的分子量大小为59.34KDa。该蛋白在N端含有信号肽和淀粉酶功能结构域，其中包括催化活性位点(图1)。

在图1所示玉足海参ɑ-淀粉酶基因序列基础上，对该基因信号肽后的前20个氨基酸的密码子进行优化。具体如下：(a)将第2和17位氨基酸密码子TTC替换为TTT；(b)将第6位氨基酸密码子GCC替换为GCG；(c)将第7位氨基酸密码子GTT替换为GTG；(d)将第8位氨基酸密码子GGA替换为GGC；(e)将第10位氨基酸密码子CGT替换为CGC；(f)将第12位氨基酸密码子ACA替换为ACC；(g)将第13位氨基酸密码子ATA替换为ATT；(h)将第16位氨基酸密码子CTT替换为CTG；(i)将第18位氨基酸密码子AGT替换为AGC。