[发明专利]一种低聚壳寡糖单体的制备方法

说明书

本发明公开了一种低聚壳寡糖单体的制备方法。本发明对壳聚糖溶液进行预处理，使壳聚糖溶液充分溶胀分散，扩大了酶与底物的接触范围，得到分布较为集中的壳寡糖产品，大大降低了单糖的生成。在制备壳寡糖的过程中与膜分离相结合，使活性壳寡糖及时得到分离，有效的控制了壳寡糖在酶作用下的进一步降解。超滤之后纳滤，除去低聚合度的无活性的寡糖和大量的水，使获得生理活性高的某聚合度范围内的壳寡糖产品。再进行凝胶排阻色谱分离，将相同组分合并收集，冷冻干燥得壳寡糖单体，得到的低聚壳寡糖单体的纯度达到40％以上。

技术领域

本发明涉及一种低聚壳寡糖单体的制备方法，属于壳寡糖制备技术领域。

背景技术

壳聚糖是甲壳素脱乙酰基的衍生物，壳聚糖来源丰富且具有多种生理活性，但由于壳聚糖分子量大，被人体、动植物吸收有限，因此制备分子量小的壳寡糖成为了该邻域的热点，制备壳寡糖的方法主要有化学法、物理法和酶法。化学法成本较低，操作简便，但是壳寡糖分子量分布难以控制，且壳寡糖结构易破坏，安全饱受质疑。物理法污染小，操作较为简单，但产物聚合度高，分子量分布也较宽，单独使用效果不佳。酶法是用专一性酶或非专一性酶对壳聚糖进行降解得到壳寡糖的方法，具有污染小，反应条件温和等优点，但往往会由于产生过多的杂志无法及时处理导致提取物纯度过低，且提取出的壳寡糖往往由于分子大小不一而未进行分类，导致产物质量过低。因此如何制得分子量和性质均一的低聚窄分布壳寡糖是壳寡糖制备中的重要问题。

发明内容

为解决上述技术问题，本发明提供一种低聚壳寡糖单体的制备方法。本发明综合使用酶法、膜分离和凝胶排阻色谱分离制备低聚壳寡糖单体，得到的低聚壳寡糖单体的纯度达到40％以上。

本发明的第一个目的是提供一种低聚壳寡糖单体的制备方法，包括如下步骤：

(1)溶解壳聚糖，加入酶进行水解，得到壳聚糖水解液；

(2)将步骤(1)得到的壳聚糖水解液经过微滤除杂，再经过超滤和纳滤处理，得到低聚壳寡糖粗品；

(3)将步骤(2)得到的低聚壳寡糖粗品通过凝胶排阻色谱进行分离，合并相同组分，得到低聚壳寡糖单体。

进一步地，所述的溶解是将壳聚糖加入水中分散均匀，再加入醋酸缓冲液进行溶解。

进一步地，所述的溶解具体是将壳聚糖加少量水溶解，再按照每g壳聚糖40-60mL加入pH 4-5的NaAc-HAc缓冲液，600-700r/min条件下常温搅拌4-6h。

进一步地，所述的酶为壳聚糖水解酶、纤维素酶、木瓜蛋白酶、脂肪酶中的一种或多种组合。优选壳聚糖水解酶。

进一步地，所述的酶的添加量为5-10U/mL，在40-50℃，200-400r/min搅拌酶解反应1-3h。

进一步地，酶解反应后，将酶解液置于80-100℃加热40-50min终止反应。

进一步地，所述的微滤是采用0.1-10μm的微滤膜进行过滤。优选先采用滤纸进行过滤，再分别使用0.45μm和0.22μm的微滤膜进行过滤除杂。

进一步地，所述的超滤的操作压力为0.2-0.3MPa，超滤膜的截留分子量为2-12KDa。优选先采用10KDa超滤膜进行超滤，再采用3KDa超滤膜进行超滤，在超滤过程中，超滤恒容加水量为原液体积的2倍，操作温度为37℃，对pH无要求。

进一步地，所述的纳滤的操作压力为0.4-0.6MPa，纳滤膜的截留分子量为400-1000Da。优选采用500Da的纳滤膜进行纳滤，纳滤恒容加水量为原液体积的4倍，操作温度为37℃，对pH无要求。