[发明专利]一种睡莲无菌材料的制备方法

说明书

本发明公开一种睡莲无菌材料的制备方法，以睡莲种子为起始材料，经预处理、消毒、预培养和萌发培养等步骤，种子萌发比自然萌发时间周期至少可缩短一半，能很快获得大量睡莲无菌材料，由此获得睡莲材料无菌率非常高。可以以此进行后续再生体系研究及作为转基因的受体材料进一步制备转基因植株，使之既能保持亲本的遗传表型，又具有所转入的外源目的基因的性状。

技术领域

本发明涉及一种植物再生和快速技术领域，具体睡莲无菌材料的制备方法。

背景技术

睡莲是睡莲科(Nymphaeaceae)睡莲属(Nymphaea)植物，主要分布在温带及热带。睡莲花色丰富、香气怡人、茎叶对水中富营养物和有害物质具有强吸附能力，被广泛应用于园林水景中。自2000年以来，国家制定并出台了一系列恢复、保护湿地的政策，城市中亲近自然、回归自然的水景设计也得到人们的喜爱和推崇，睡莲是热门水生植物之一，市场需求广阔。

睡莲的繁殖方式有分株和播种两种(黄国振,邓惠勤,邹秀文,李钢.睡莲属植物的繁殖形式[J].中国花卉园艺,2003(04):26-27)。睡莲栽培品种一般杂合程度较高，不宜用种子繁殖；分株法繁殖系数低，对温度要求严格，受季节限制大。睡莲新品种培育主要集中在耐寒型、热带型、跨亚属杂交等研究，我国睡莲育种起步于20世纪90年代，杂交育种和选择育种是我国育种者培育睡莲新品种的主要方法(李钢，.睡莲、荷花新品种的研发与产业发展[J].花木盆景(花卉园艺),2008(09)：49-50)。目前，睡莲育种中绝大多数还是通过人工杂交和自然杂交的手段，结果的随机性较强(唐毓玮,毛立彦,於艳萍,陆祖正,丁丽琼,荣涛,龙凌云,谢振兴.我国睡莲属植物育种研究进展.农业研究与应用，2019，32(01)：36-41；李淑娟,尉倩,陈尘,张燕,吴永朋,余刚.中国睡莲属植物育种研究进展.植物遗传资源学报，2019,20(04)：829-835)。余翠薇等(热带睡莲胆碱氧化酶基因CodA的转化及其耐寒生理研究..浙江大学(硕士论文)，2017)利用花粉管通道法将转基因技术应用到睡莲育种中，但这仅仅只是一个开始，今后还应加大分子育种技术在睡莲育种中应用的力度和范围，如独特的花色、抗逆性、株型的大小等，可提高定向育种的效率。这种无菌材料制备方法是基因编辑技术的前提。转基因技术和基因编辑技术是当下热门的两项基因操作新技术，主要通过对基因组进行定向改造来获得目的种质材料。植物组织及细胞培养技术成为植物遗传转化和基因编辑的关键限速步骤。可见，无论是睡莲离体繁育，还是基因工程育种，都需要建立睡莲的离体再生体系。

然而，睡莲属于水生植物，喜肥沃的淤泥环境，无菌材料的获得成为睡莲离体再生体系建立的技术瓶颈。基于其主要原因是睡莲是水生植物，花从淤泥水中长出，难以获得无菌材料。目前虽然有睡莲离体再生的尝试，如白芳芳，闫长松报道(.荷花、睡莲根段繁殖试验.陕西林业科技，2019，47(03)：22-24)采根段进行繁殖。但尚没有建立有效的离体再生体系。因此，国内外未见睡莲离体再生的成功报道，需要研发睡莲的再生体系。

发明内容

为尽快实现睡莲高效离体再生体系建立和加快睡莲育种进程，本发明人开展了睡莲的无菌材料制备研究，获得了其无菌材料的制备方法。因而本发明首次以睡莲种子培养成功获得无菌材料。

本发明首先提供一种睡莲无菌材料的制备方法，其包括如下步骤：

(1)清洗去除表面假种皮且进行初步表面消毒；

(2)将种子浸泡处理液进行种子催芽1至3天，所述种子浸泡液含0.5至1.5mg/LGA₃和0.05至0.2mg/L BA的溶液；

(3)将浸泡处理的种子用乙醇和次氯酸钠溶液依次消毒；

(4)再将种子于萌发培养基上培养到发芽。

优选地，第(1)步消毒进一步分成两步消毒，即：

(a)将清洗的睡莲种子于洗洁精和吐温溶液浸泡，期间搅拌；更优选地，用搅拌器中速搅拌烧杯中液体10-30min后取出睡莲种子；