[发明专利]高通量测序文库的构建方法以及用于文库构建的试剂盒

说明书

本发明提供一种高通量测序文库的构建方法以及用于文库构建的试剂盒。所述试剂盒包含如下成分中的至少一种：高通量测序Y型接头，用于单端线性PCR扩增的通用引物，用于单端线性多重PCR扩增的生物素标记特异性引物，正、反向文库扩增引物，UDG酶等。基于该试剂盒构建靶向双分子标签(UMI分子标签和链特异性分子标签)高通量测序文库的方法。本方法在基于多重PCR扩增的靶向测序体系中实现了随机分子标签UMI和序列多态性的链特异性分子标签双重纠错机制的同时，规避了绝大多数常规多重PCR扩增靶向测序体系的弊端，从而摒除了突变检测中的一切假阳性和假阴性，可对样品中的低频核酸突变进行高灵敏度，精准度以及高深度的检测。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体地说，涉及一种高通量测序文库的构建方法以及用于文库构建的试剂盒。

背景技术

基因突变是有机体基因组核酸序列发生的永久性改变。突变通常来自于基因复制过程中的错误，或来自于其他形式的可逃逸机体内DNA错误校正修复机制的单链 DNA损伤。一般认为，有机体内的突变包括体细胞突变和胚系突变。其中，体细胞突变是癌症的主要特征之一，因此体细胞突变检测的准确性、灵敏度、特异性对于癌症早期诊断、伴随诊断和使用针对突变的靶向小分子药物进行后续治疗至关重要。而对于来自于胚系的突变，以人的二倍体基因组为例，遵循孟德尔遗传规律的遗传突变的等位基因频率通常为0％、50％以及100％，检测难度不大，但是对于等位基因频率(Allelic frequency)在10％甚至小于10％的新生突变或嵌合突变，以及遗传病领域重点关注的重复/缺失，突变检测的检测限、准确性和灵敏性对于早期提前干预，重症的亲体移植指导同样至关重要。近年来，随着高通量测序成本的降低，如全基因组测序(WGS)、全外显子组测序(WES)、靶向测序(Targetsequencing)等技术被更多地运用到胚系突变和肿瘤体细胞突变检测上。

用于高通量测序的高保真DNA聚合酶的错误率普遍约为1/10⁶，而Illumina测序平台的测序错误率约为1/10²～1/10³；在上机测序的过程中，双链DNA经过碱变性，在测序flowcell上以单链DNA形式成簇，并最终以单链的形式被测序。因此发生在文库构建过程中PCR扩增引发的错误或测序中由于光学信号或其他原因引入的测序错误会造成假阳性突变结果的产生，导致低于1％的突变几乎无法进行检测；同时，发生在 DNA复制早期单链损伤可能导致的碱基错配和后续的测序读取错误(如G→A及C→ T)，这些结果都会干扰到真正突变的检出或影响准确的突变频率的计算。

对于基于液相杂交捕获的全外显子组测序来说，存在人类85％致病突变的30Mb外显子区域即使测到10Gb的数据量，受捕获效率的影响，各个位点也仅能达到 100-200倍的平均测序深度，有效测序深度往往在100倍左右。这个测序深度对于突变频率较低体细胞突变和嵌合突变是远远不够的。因此，针对特定疾病相关基因或基因热点区的靶向测序技术越来越受到青睐。靶向测序技术以液相杂交捕获系统 (Capture Panel)和多重PCR扩增子(multiplexing-PCR amplicon)系统为两大技术阵营，而无论是基于液相杂交捕获Panel还是多重PCR扩增子的靶向测序技术，PCR扩增错误、测序错误，早期DNA损伤等都会混杂在最后的测序结果中无法正确分辨。

目前为止，基于多重PCR靶向测序平台，同时携带分子标签和链标签纠错机制的技术尚未有发表的研究结果和商品化产品。现已上市的类似商品化试剂盒一般只单独使用UMI(Unique molecular index)标记进行纠错。目前基于多重PCR扩增的靶向测序技术的纠错功能多为使用耦合随机碱基UMI到位点特异性引物的5’端，进行2～3 轮扩增得到完整的高通量测序文库结构；随着UMI随机碱基个数的增加，位点特异性引物的特异性结合会下降，导致上靶率下降；同时，常规多重PCR靶向测序建库体系中，在重叠区域设计的多对正反向引物在扩增中会产生非特异性扩增产物，这些非特异性扩增产物往往在扩增中占主导地位，严重影响目标区域的扩增效率；常规正反向引物设计导致对于类似cfDNA这种短DNA片段的利用率极低。