[发明专利]赤眼鳟LGP2基因多克隆抗体的制备方法

权利要求书

1.赤眼鳟LGP2基因多克隆抗体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)赤眼鳟LGP2基因的克隆

提取赤眼鳟肾脏组织总RNA，反转录合成5’和3’cDNA第一链；设计两对特异性引物：LGP2-5’(W)和LGP2-3’(W)，LGP2-5’(N)和LGP2-3’(N)，核苷酸序列分别如SEQ ID No.1、SEQID No.2、SEQ ID No.3、和SEQ ID No.4所示；LGP2-5’(W)和LGP2-3’(W)分别用于第一轮的5’和3’RACE-PCR扩增；所得PCR产物作为第二轮PCR的模板；利用LGP2-5’(N)和LGP2-3’(N)进行第二轮5’和3’RACE-PCR扩增；对PCR产物进行纯化、连接T载体，转化并测序确认；拼接产物序列获得赤眼鳟LGP2基因全长cDNA序列；

(2)赤眼鳟LGP2基因重组表达载体的构建

设计特异性引物LGP2-OF和LGP2-OR，核苷酸序列分别如SEQ ID No.5和SEQ ID No.6所示；以步骤(1)得到的cDNA为模板进行PCR扩增；将PCR产物和pET-28a(+)表达载体进行KpnI和BamHI的双酶切，纯化回收，经T4连接酶连接后转化大肠杆菌DH5α，获得重组表达载体pET-28a-SUMO-LGP2并测序验证；

(3)赤眼鳟LGP2蛋白表达及破菌流程

将步骤(3)得到的重组表达载体pET-28a-SUMO-LGP2转化大肠杆菌BL21(DE3)，在含有卡那霉素的LB培养液中培养至OD值为0.6，加入IPTG进行诱导；离心收集菌体；破菌，利用SDS-PAGE电泳确定蛋白表达及纯度；

(4)重组蛋白的纯化及浓度测定

利用纯化试剂盒对步骤(3)得到的重组蛋白上样、洗脱、样品处理及再生处理方法进行纯化；采用Lowry法测蛋白浓度，设置不同浓度的标准蛋白质溶液，绘制标准曲线，根据样品的光吸收值与标准曲线计算样品蛋白浓度；

(5)多克隆抗体的制备

将步骤(4)纯化的赤眼鳟pET-28a-SUMO-LGP2表达蛋白作为抗原，对新西兰大白兔进行免疫，收集兔抗血清，纯化得到赤眼鳟LGP2多克隆抗体。

2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，第一轮的5’和3’RACE-PCR扩增反应程序为94℃5min；5个循环的94℃30s，72℃3min；5个循环的94℃30s，70℃30s，72℃3min；25个循环的94℃30s，68℃30s，72℃3min。

3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，第二轮5’和3’RACE-PCR扩增反应程序为94℃5min；25个循环的94℃30s，68℃30s，72℃3min，然后72℃7min。

4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(3)中，破菌的方法为：取50mL的1×PBS悬浮菌液，加入50μL巯基乙醇，利用超声破碎仪，设置破菌时间3s，间隔3s，共10min超声破菌，离心10min得到1号上清液和沉淀，其中沉淀用去离子水洗涤两遍，加入6g尿素并用1×PBS溶解定容到44mL，吹悬沉淀；按破菌3s，间隔3s的设置，破菌5min后12000r/min离心10min得到2号上清液和包涵体，吸出2号上清液暂放4℃保存待用，向包涵体中加入6mLddH₂O悬浮后平均分装到4个离心管中，12000r/min离心2min；弃上清，选取其中一管加入1.5mL 8M的尿素，溶解，12000r/min离心1min，将上清转移到新的离心管中。

5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(5)中，对新西兰大白兔进行免疫的方法为：对新西兰大白兔进行8次免疫，按体积比1：1的比例加入弗氏完全佐剂，采用背部皮下多点注射；加强免疫选用弗氏不完全佐剂；末次免疫10天后，进行全血分离，收集兔抗血清。