[发明专利]大株红景天注射液中对羟基苯乙酸的含量测定方法

说明书

本发明公开了一种大株红景天注射液中对羟基苯乙酸的含量测定方法，属于中药化学研究领域。本发明以大株红景天注射液为原料，经硅胶柱层析、制备液相分离纯化并利用C¹³‑NMR等波谱学手段证明了其中对羟基苯乙酸的存在，并在此基础上建立了测定其含量的HPLC测定方法。

技术领域

本发明涉及中药化学领域，具体涉及一种大株红景天注射液中对羟基苯乙酸的含量测定方法。

背景技术

大株红景天Rhodiola wallichiana(HK.)S.H.Fu var.cholaensis(Praeger)S.H.Fu为景天科红景天属多年生草本植物，又名大株粗茎红景天，2000多年前的《神农本草经》、唐代的《千金翼方》和明代的《本草纲目》均有记载，主产于西藏、四川及云南等地。现代研究表明，大株红景天主要化学成分有糖苷类、香豆素类、黄酮类、挥发油、生物碱、甾体、酚类化合物以及有机酸(没食子酸、草酸、柠檬酸、苹果酸、琥珀酸)和微量无机元素等，具有明显的抗肿瘤、抗衰老、抗缺氧、抗辐射、抗疲劳以及调节神经系统等作用，被广泛用于医疗、保健品、化妆品等领域。

大株大株红景天注射液(国药准字Z20060361)是由景天科植物大株红景天Rhodiola Kirilowii(Regel)Regel.的干燥根及根茎经水提醇沉工艺制成，为淡黄色至棕黄色的澄明液体，具有活血化瘀、通脉止痛之功效，主治冠心病、心绞痛。

目前国内外对大株红景天化学成分研究报道较少，主要集中在酪醇及其苷类、黄酮苷类、酚酸类、苯丙素类以及萜类等化合物，含量测定方面的研究多集中于红景天苷、酪醇和没食子酸等。关于大株红景天注射液的研究多集中于药理作用和临床应用，尚未发现从大株红景天注射液中发现对羟基苯乙酸以及其含量测定的文献报道。

发明内容

本发明从大株红景天注射液中分离纯化得到对羟基苯乙酸，在此基础上建立了其含量测定方法。

为实现上述目的，本发明采用了以下技术方案：

首先取40支大株红景天注射液冻干，固形物以二氯甲烷-甲醇-水＝7:1.2:0.2和二氯甲烷-甲醇-水＝5:3:0.8为流动相进行硅胶柱层析(展开剂：氯仿-甲醇-水＝7:1:0.1、9:3:0.2和5:3:0.7)，得到含对羟基苯乙酸的样品粉末2.3g。将此样品用流动相溶解，利用制备型高效液相色谱仪(流动相为乙腈-水＝95:5)进行纯化，收集含对羟基苯乙酸的流分，回收溶剂后冻干，得到对羟基苯乙酸42.8mg。将其核磁数据与文献报道的对羟基苯乙酸核磁数据对比，确定其为对羟基苯乙酸，经高效液相色谱仪检测，其纯度为98.96％。核磁数据如下：核磁数据：¹³C NMR(CD₃OD，150MHz)δ_C：127.68(C-1)，131.59(C-2,6)，116.45(C-3,5)，157.59(C-4)，177.46(-COOH)。^1H NMR(CD₃OD，600MHz)δ_H：7.18(d,J＝8.4Hz,2H)，6.81(d,J＝8.5Hz,2H)，3.56(s,2H)。

在此基础上建立的大株红景天注射液中对羟基苯乙酸的HPLC含量测定方法如下。

色谱条件：

流动相为乙腈(A)-0.05％磷酸溶液(B)；梯度洗脱程序为0～200min，溶液A：5％～7％，溶液B：95％～93％；柱温为30℃；流速为1.0mL·min^-1；检测波长为276nm；进样体积为20μL。

供试品溶液的制备：

取1支大株红景天注射液冻干，固形物用甲醇或乙腈或它们与水的混合溶液溶解并定容到指定体积，摇匀，过滤，制成供试品溶液。

对照品溶液的制备：