[发明专利]一株高产角蛋白酶的地衣芽孢杆菌菌株及其应用

说明书

本发明属于生物工程技术领域，特别涉及一株高产角蛋白酶的地衣芽孢杆菌菌株及其应用。所述菌株具体为地衣芽孢杆菌(Bucillus licheniformis)JR‑101，保藏编号为CGMCC No.18643。该菌株经过液态发酵生产的角蛋白酶，具有耐热、酶活力高、pH作用范围广泛、性能稳定而且价格较低的特点，应用范围广泛。

技术领域：

本发明属于生物工程技术领域，特别涉及一株高产角蛋白酶的地衣芽孢杆菌菌株及其应用。

背景技术：

角蛋白广泛存在于自然界中，主要来源于动物的外胚层细胞，包括皮肤及皮肤的衍生物，如羽毛、指甲、毛发等，是一种很难降解的硬性蛋白。角蛋白的化学结构比较稳定，不溶于水，难被胃蛋白酶、胰蛋白酶等蛋白酶水解。角蛋白是一种具有极强抗性、难生物降解的硬蛋白，动物难以直接利用，而传统的物理和化学加工方法(如酸碱处理、高温高压等)不仅消耗大量能源还引发严重的环境污染问题。

角蛋白酶是一种新型的蛋白水解酶，它能够将角蛋白水解成游离的氨基酸或多肽。角蛋白酶的这种特性，可以用来处理废弃的动物羽毛和毛发等，一方面可以减少羽毛等废弃物对环境的污染，同时可以作为一种优良的蛋白质资源，对缓解蛋白资源供应紧张的局面有重要作用。能够被角蛋白酶水解的底物较多，如胶原蛋白、角蛋白和弹性蛋白等，并且对这些蛋白质的水解能力比常见的蛋白酶高，可以广泛的应用于动物饲料、皮革工业、医药原料及环境治理方面。

目前发现可降解角蛋白的微生物有30多种，其中有细菌、真菌和放线菌。拥有热稳定性较差的角蛋白酶严重影响其在工业上的应用，所以提高角蛋白酶的热稳定性有利于工业化应用。

发明内容：

为了解决上述技术问题，本发明将提供一株产热稳定性高的角蛋白酶的地衣芽孢杆菌，该菌株是经NTG诱变后获得的，具体为地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)JR-101，该菌株已于2019年10月9日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.18643。

本发明的目的还在于提供一种发酵酶活力高、提取收率高、制造成本低的角蛋白酶的液态微生物发酵生产方法。本发明的目的可以通过以下措施来实现：

1.液态发酵生产角蛋白酶

培养基质量体积百分比组成如下：

a.发酵罐培养基：玉米淀粉2.5％，玉米粉3.5％，羽毛粉1.5％，黄豆粉3.5％，玉米浆3％，蔗糖3.2％，磷酸二氢钾1.7％，硫酸镁0.27％，pH 6.5；

b.发酵罐灭菌工艺条件：121℃-124℃，0.11-0.12MPa条件下，灭菌35min。

c.发酵罐发酵工艺条件：接种量5％，罐压0.05-0.08Mpa，培养温度37℃，转速300-800r/min，当溶氧降至最低再升至20％时，开始补料，控制溶氧在20％-30％，发酵至菌体自溶严重，酶活无明显提高时放罐；

2.补料

a.补料培养基：玉米淀粉25％，豆饼粉5.2％，玉米浆2.3％，羽毛粉1.5％，硫酸铵0.5％，磷酸二氢钾0.2％，pH 6.5。

b.补料方法：当溶氧降至最低再升至20％时，开始补料，控制溶氧在20％-30％。

3.放罐

培养至96-110h，酶活增长缓慢，菌体开始部分自溶，即可放罐。发酵结束时，发酵液酶活力平均达到27703U/mL。

4.角蛋白酶的提取与精制

发酵结束后，按发酵液体积加入40％的水和0.3％氯化钙，加入3％珍珠岩助滤剂，进行压滤，滤液经超滤浓缩后可进行酒精溶析得到固体酶制剂，也可将浓缩液加入20％甘油作稳定剂得到液体酶制剂。