[发明专利]一种基于毛细管电泳的腺病毒分型检测试剂盒及其使用方法

说明书

本发明公开了一种基于毛细管电泳的腺病毒分型检测试剂盒及其使用方法。所述试剂盒包括PCR引物组；所述PCR引物组包括12种腺病毒血清型正反向引物、总腺病毒正反向引物、人类基因组内参正反向引物和PCR反应内参正反向引物。所述试剂盒的使用方法包括如下步骤：(1)对痰液或者咽拭子样本前处理后，提取核酸；(2)对提取后的核酸进行多重PCR扩增；(3)采用毛细管电泳法分离PCR产物；(4)结果分析判读。本发明采用多重PCR结合毛细管电泳分析方法，快速对12种腺病毒血清型进行分型检测。本发明的优势是灵敏度高、特异性强、通量高、成本低，能快速同步检测多种腺病毒血清型，克服了传统方法存在的缺陷。

技术领域

本发明涉及基因检测技术领域，具体涉及一种基于毛细管电泳的腺病毒分型检测试剂盒及其使用方法。

背景技术

人腺病毒(Human adenovirus，HADV)属于哺乳动物腺病毒属，为无包膜的双链DNA病毒，1953年由Rowe等首次发现。目前已发现至少90个基因型，分为A-G共7个亚属，不同型别HADV的组织嗜性、致病力、流行地区等特性不同。

HADV感染可引起多种疾病，包括肺炎、支气管炎、膀胱炎、眼结膜炎、胃肠道疾病及脑炎等。与呼吸道感染相关的HADV主要有B 亚属(HADV3、7、14、21、55型)，C亚属(HADV1、2、5型) 和E亚属(HADV4型)等。腺病毒肺炎约占社区获得性肺炎的 4％～10％，重症肺炎以3型及7型多见。

HADV引起的肺炎是儿童社区获得性肺炎中较为严重的类型之一，多发于6个月至5岁儿童，部分患儿临床表现重，肺外并发症多，重症病例易遗留慢性气道和肺疾病，是目前造成婴幼儿肺炎死亡和致残的重要原因之一，因此受到高度关注。

现有的腺病毒分型方法主要有四种：病毒分离和血清学鉴定、抗原检测、基因芯片技术、测序法。现简述如下：

1、病毒分离和血清学鉴定：传统的病毒分离培养和血清分型方法是诊断腺病毒的金标准。病毒分离培养是将临床样本接种于敏感细胞，如Hep-2等，通过细胞培养观察CPE(cytopathic effect致细胞病变效应)，分离腺病毒。腺病毒血清分型主要依据中和试验和血凝抑制试验，前者通过直接检测腺病毒六邻体蛋白的抗原决定簇，而后者依据五邻体蛋白的抗原决定簇的检测结果而判定血清型。因此，病毒分离培养和血清分型方法难度高，耗时长，价格昂贵，阳性检测率低，需要有经验的专业人员，不适于临床检测。

2、抗原检测：主要针对腺病毒衣壳六邻体抗原进行检测，多采用免疫荧光方法，其中直接免疫荧光(DFA)快速诊断技术为多数临床实验室所接受。其基本原理是用已知的抗体标记上荧光素后成为特异性荧光抗体，染色时将该抗体直接滴在载玻片上进行孵育，使之直接与载玻片上的抗原结合，在荧光显微镜下直接观察，作出判断。该方法简单易行、特异性高、快速方便。但其不足是只能检测相应的一种分型，通量低，敏感性较差。

3、基因芯片技术：

基因芯片是通过微加工技术，将数以万计、乃至百万计的特定序列的DNA片段(基因探针)，有规律地排列固定于硅片、玻片等支持物上，构成的一个二维DNA探针阵列，利用这类芯片与标记的生物样品进行杂交，可对样品的基因表达谱生物信息进行快速定性和定量分析。其优点是通量高、操作简便；缺点是检测成本昂贵、重复性差、灵敏度较低。此外，芯片的种类较多，难以制定一个统一的质量控制标准也限制了基因芯片技术的普及。

4、测序法：

测序法能对腺病毒的核酸进行最全面和最直观的解读，并且可以对所有血清型的腺病毒进行准确分型。但是Sanger测序法操作复杂、成本较高、周期长，需要一个靶点接着一个靶点测序，多个靶点测序耗时长、累计价格相对昂贵。二代测序技术实现了边合成边测序，具有高通量、高效率的优势。然而二代测序平台价格昂贵、普及度低，作为临床检测技术还不够成熟。