[发明专利]抗RET突变体蛋白单克隆抗体可变区序列的制备方法

说明书

本发明公开了一种抗RET突变体蛋白单克隆抗体可变区序列的制备方法，针对RET蛋白C634位点进行突变，合成多肽序列，分别将多肽与载体蛋白KLH进行偶联并与弗氏佐剂进行乳化，制得乳化抗原，将突变体分别构建表达序列至紫色荧光蛋白mcherry氨基端并与表达载体结合，制得检测原，通过乳化抗原对小鼠进行免疫，将小鼠骨髓瘤SP2/0细胞和免疫小鼠脾细胞进行细胞融合，并用半固体培养基和检测原进行培养，通过观察克隆团形成及培养基颜色变化，将阳性克隆挑选至新6孔板中，并改用液体培养基进行扩大培养，将各细胞株再转移至摇瓶培养，收集培养基上清，进行抗体纯化，对抗体进行测序，获得可变区序列。

技术领域

本发明属于单克隆抗体制备领域，具体涉及一种抗RET突变体蛋白单克隆抗体可变区序列的制备方法。

背景技术

RET原癌基因编码一组属于络氨酸激酶受体超家族的跨膜蛋白即RET蛋白，受体络氨酸酶在细胞外环境与细胞核之间起着连接作用，信号从细胞表面传导在细胞质，再到细胞核，该受体的细胞外部分区域在连接特殊的配体后形成受体间聚合，促使激酶的激活，RET基因突变在多方面增强了RET络氨酸激酶信号转导的功能，促使激酶的活化和原癌基因的转化，其突变与多种疾病的发生密切先关，包括多发性内分泌腺瘤病2型、甲状腺乳头状癌、先天性巨结肠及肺腺癌等，其不同的突变类型可导致肿瘤侵袭能力不同；

甲状腺髓样癌(MTC)可以分为散发性甲状腺髓样癌(SMTC)和遗传性甲状腺髓样癌(HMTC)两种，大量研究已确认原癌基因(RET)突变是甲状腺髓样癌发病的主要分子病因学基础，约95％的SMTC和80％以上的HMTC是由RET基因突变引起，目前临床研究只限于以基因测序为基础的分子水平，而理论上RET基因突变后最终会导致RET蛋白的氨基酸突变才能引起疾病的产生，但目前尚未有关于RET蛋白点突变的具体研究；

抗体是指机体由于抗原的刺激而产生的具有保护作用的蛋白质，通过抗RET突变体蛋白制备的抗体，可以很好的抑制RET突变体蛋白作用，传统制备抗体的方式是通过人工制备的杂交瘤细胞产生单克隆抗体来制备抗体的，常用的单克隆抗体制备方法，多以蛋白做为抗原进行免疫制备的单克隆抗体，制备出的单克隆抗体无法检测出蛋白突变体种类，在单克隆抗体制备过程中，采用液体培养基的形式对杂交瘤细胞进行培养，操作较为复杂，需要进行亚克隆才能制得单克隆抗体，并在杂交瘤阳性细胞株筛选时常用ELISA检测法，ELISA检测法不论通过仪器还是手工操作，干扰因素较多，同时受自身抗体、嗜异性抗体等干扰，易出现假阳性，易影响检测结果，使得单克隆抗体制备效率较低。

发明内容

本发明的目的在于提供抗RET突变体蛋白单克隆抗体可变区序列的制备方法，针对RET蛋白C634位点已经报道的6种突变体合成突变后多肽序列，分别将6种多肽与载体蛋白KLH进行偶联并与弗氏佐剂进行乳化，制得乳化抗原，将突变体分别构建表达序列至紫色荧光蛋白mcherry氨基端并与表达载体结合，制得检测原，通过乳化抗原对小鼠进行免疫，将小鼠骨髓瘤细胞SP2/0和免疫小鼠脾细胞进行细胞融合，采用半固体培养法对杂交瘤细胞进行培养，通过观察克隆团形成及培养基颜色变化，将阳性克隆挑选至新6孔板中，并改用液体培养基进行扩大培养，将各细胞株再转移至摇瓶培养，收集培养基上清，进行抗体纯化，对抗体进行测序，获得抗RET突变体蛋白单克隆抗体可变区序列。

本发明要解决的技术问题：

1、常用的单克隆抗体制备方法，多以蛋白做为抗原进行免疫制备的单克隆抗体，制备出的单克隆抗体无法检测出蛋白突变体种类；

2、在传统的单克隆抗体制备中，采用液体培养基的形式对杂交瘤细胞进行培养，操作较为复杂，需要进行亚克隆才能制得单克隆抗体；

3、在杂交瘤阳性细胞株筛选时常用EL ISA检测法，但ELISA检测法不论通过仪器还是手工操作，干扰因素较多，同时受自身抗体、嗜异性抗体等干扰，易出现假阳性，易影响检测结果；