[发明专利]单味中药治疗老年性瓣膜病药物筛选体系的构建方法

权利要求书

1.单味中药治疗老年性瓣膜病药物筛选体系的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)pmirGLO-RAGE5’-UTR及pmirGLO-mut-RAGE载体的构建:在RAGE5’端UTR中exon选择46个碱基构成的序列pmirGLO-RAGE5’-UTR载体和pmirGLO-mut-RAGE载体；

(2)在目的片段的5’端和3’端分别加入了Sac I和Xho I两个限制性内酶切位点；

(3)基因目的片段退火合成双链DNA，95℃热变性2min，每90s温度下降1℃，至25℃，放置30min，4℃存，-20℃冻存备用；

(4)用Sac I和Xho I酶对pmir GLO载体进行双酶切，使之解链成线性化；

(5)双酶切产物经琼脂糖凝胶电泳进行DNA回收，再将线性载体和RAGE5’-UTR载体相连接；

(6)同法连接突变型目的片段，构建突变型重组载体质粒；将两种重组载体质粒和空载体质粒分别转化大肠杆菌DH5ɑ，挑取菌落，进行质粒的抽提和鉴定；

(7)培养293T细胞，通过LipofectamineTM2000(promega)转入含有重组pmirGLO-RAGE5’-UTR或pmirGLO-mut-RAGE的质粒，转染24小时后，检测转染效率，选取稳定转染的细胞，即构建成功筛选系统；

(8)将含药血清加入构建的PmirGLO-RAGE 3’-UTR细胞检测系统，24小时后进行双荧光报告基因检测，通过荧光强弱筛选出有效抑制RAGE的药物。

2.根据权利要求1所述单味中药治疗老年性瓣膜病药物筛选体系的构建方法，其特征在于，所述pmirGLO-RAGE5’-UTR载体

正义链：

5’-GATCGGGGGCTCTGAGGGAATGAGACCCTAGAGGGTACACTCCCC-3’

反义链：

5’-TCGAGGGGGAGTACCCTCTAGGGTCTCATTCCCTCAGCCCCCGATCGAGCT-3’。

3.根据权利要求1所述单味中药治疗老年性瓣膜病药物筛选体系的构建方法，其特征在于，所述pmirGLO-mut-RAGE载体

正义链：

5’-GATCGGGGGCTCTGAGTAGTGAGACCCTAGAGGGTACACTCCCC-3’

反义链：

5’-TCGAGGGGGAGTACCCTCTAGGGTCTCACTACTCAGCCCCCGATCGAGCT-3’。