[发明专利]一种利用长春花富集枣疯病植原体的方法

说明书

本发明公开了一种利用长春花富集枣疯病植原体的方法，所述方法是以长春花为砧木，以枣疯病枝为接穗进行嫁接，然后将嫁接后的植株移至人工气候控制室内培养，先在23℃，相对湿度85％的条件下进行1d暗培养，然后改为在16h光周期、23℃、相对湿度65％条件下培养至发病为止。该方法较好实现了枣疯病植原体的富集，从而较好克服了现有枣疯病植原体分离研究中的植原体在原始寄主内含量低、分离困难及操作繁琐等问题，进而为枣疯病植原体的深入研究及如何防治枣疯病奠定了基础。

技术领域

本发明属于植原体保存技术领域，具体涉及一种利用长春花保存和富集枣疯病植原体的方法。

背景技术

枣疯病(jujube witches’broom)是由植原体(phytoplasma)引起的，是在东亚地区广泛蔓延的一种流行性病害。因其防治难度大，兼具传播速度快、致病力高、具有毁灭性等特点，因此又被称之为“枣癌症”。而枣树一旦感染枣疯病将出现丛枝、矮化、不育等症状，进而对枣产业造成严重的经济损失。研究表明，枣疯病的病原-植原体专性寄生在植物韧皮部和幼嫩组织中，无法离体培养，这为该种病害的研究带来了很大的困难。而由于病原无法离体培养，枣疯病的发病机理尚不明确，因此砍除和烧毁感病植株，消除植原体的来源，是枣疯病防治过程中最常用的方法。但这种方法耗费大量人力物力，且对枣树造成不可逆的伤害。因此如何快速准确地将枣疯病植原体与寄主分离，获取植原体基因组信息，明确枣疯病发生机理是目前该类病害防治研究的重点方向。

现有技术中，分离植原体的主要方法包括密度梯度超速离心法及差速离心结合脉冲电泳分离法。密度梯度超速离心法的原理是将植物病组总DNA溶于不同浓度梯度的氯化铯或蔗糖溶液中，使用超速离心机使得不同密度的DNA在溶液中呈现梯度分离。而差速离心结合脉冲电泳法的原理是通过多次的差速离心逐步去除寄主细胞组分，获取植原体。两种方法都可以一定程度上分离枣疯病植原体。具体例如：陈昱圻以枣疯病叶为材料，利用氯化铯密度梯度离心结合Real-time PCR法分离得到较为纯净的枣疯病植原体DNA(陈昱圻等，超速离心结合Real-time PCR分离纯化枣疯病植原体DNA，北京农学院学报，2015，30(2)：5-9)；傅强等以感病组培苗为材料，使用差速离心结合脉冲电泳法成功在1600 kb-2200kb之间分离得到一条明亮条带，经过PCR检测，证明该条带是植原体DNA(傅强等，差速离心结合脉冲电泳分离枣疯病植原体DNA，江西农业学报，2016(12)：66-69)。但是这些分离方法都无法成功分离到高质量的枣疯病植原体，主要原因在于，植原体只寄生在植物韧皮部及幼嫩部位，而此部位的植原体的浓度很低，无法大量聚集，从而使得最终得到的植原体DNA质量不高且有大量的寄主基因组干扰，进一步地， DNA浓度和纯度均无法达到测序要求。因此，能否获得大量富集枣疯病植原体的植物材料是该类病原被成功分离的关键因素。

对植原体的相关宿主研究表明，植原体在寄主昆虫及草本植物中的浓度要远远高于木本植物中。而由于枣疯病植原体的介体昆虫(中华菱纹叶蝉等)个头小，较难捕捉及培养，且生长周期短，因此，筛选能够在体内富集枣疯病植原体的草本植物并将其作为植原体分离材料是较为可行的策略。

长春花(Catharanthus roseus)别名金盏草、四时春、日日新、雁头红、三万花，为多年生草本植物。近年来在国外分离植原体的研究中，长春花因可以富集多种植原体而大量被培育。例如，陈旺等通过条沙叶蝉(Psammotettix striatus L.)将小麦蓝矮(Wheatblue dwarf)植原体传播到长春花中，并最终利用差速离心法分离得到了WBD植原体的染色体 DNA(陈旺等，小麦蓝矮植原体染色体DNA的分离，微生物学通报，2013， 40(4)：706-710)。而针对如何利用长春花来富集枣疯病植原体，则未见到相关报道。

发明内容

本发明的目的在于一种提供利用长春花富集枣疯病植原体的方法，用以解决现有技术中枣疯病植原体难以大量获取的难题。

为实现上述目的，本发明采取如下技术方案：