[发明专利]新城疫病毒和H9N2亚型禽流感病毒检测阳性标准品及其制备方法与应用

说明书

本发明属于分子生物学检测领域，具体涉及一种新城疫病毒和H9N2亚型禽流感病毒检测阳性标准品及其制备方法与应用。筛选H9N2亚型禽流感病毒的扩增引物及新城疫病毒的扩增引物，扩增后的目的片段与载体连接，筛选验证阳性重组质粒，计算阳性标准品浓度，绘制标准品曲线，实现定性及定量测定；最后通过稳定高效的阳性标准品的制备和应用，实现待测样品的定性和定量检测，非常适用于H9N2亚型禽流感病毒和新城疫病毒的诊断。

技术领域

本发明属于分子生物学检测领域，具体涉及一种新城疫病毒和H9N2亚型禽流感病毒检测阳性标准品及其制备方法与应用。

背景技术

新城疫（Newcastle disease，ND）俗称鸡瘟，是由新城疫病毒（Newcastle diseasevirus，NDV）引起的一种高度接触性急性传染病，它以肠炎、严重腹泻和神经症状为特征，是危害养禽业的重要疫病之一，可造成很大的经济损失。除了首次大流行引起爆发以来，ND共发生了3次世界范围的流行和爆发。上世纪60年代后期，该病从中东迅速传播到世界范围内的许多地区，造成了本病的第二次大流行。随后，不到十年的时间，七十年代中期又发生了该病的第三次流行。第四次大流行发生于七十年代晚期，发病的源头是鸽源副粘病毒I型。该病至今仍在世界范围内广泛发生，特别是在欧洲、亚洲的许多国家。世界动物卫生组织（OIE）将该病列为A类传染病，即必上报疾病，我国也将该病列为一类动物疾病。

禽流感是由A型禽流感病毒（Avian influenza virus，AIV）引发的接触性传染性病毒病。目前，多种亚型AIV可以导致养禽业的巨大经济损失，同时还会危害到人类公共卫生安全，因此禽流感的危害性不容小视。一旦禽类感染H9亚型AIV，临床症状可表现为生殖道炎症、呼吸道感染、蛋鸡产蛋量下降。目前，虽然感染H9亚型AIV的禽类死亡率不高，但由于病毒感染可造成免疫抑制和蛋鸡的产蛋量下降，可造成养禽业巨大的经济损失。 H9N2亚型AIV目前已呈世界性分布，根据病原分布和遗传进化角度不同可分为北美和欧亚两个种系。我国于1994年首次公开报道H9N2亚型AIV的出现，目前该病原广泛存在于我国大部分地区，与其他病原共感染时常导致病禽生产性能严重下降，死淘率升高。

在病原微生物的检测中，阳性标准品的制备和应用必不可少。通过标准品的参照，可判断待测样品是否为阳性，亦可通过标准品得出待检测模板的浓度含量。

发明内容

本发明以H9N2亚型禽流感和基因Ⅶ型新城疫病毒为研究对象，通过稳定高效的阳性标准品的制备和应用，实现待测样品的定性和定量检测，非常适用于H9N2亚型禽流感病毒和新城疫病毒的诊断。

一种新城疫病毒和H9N2亚型禽流感病毒检测阳性标准品，包括以下碱基序列：

H9-F碱基序列如SEQ No.1所示；具体为: 5′-ATTTCACAACCACTCAAGATGGAA-3′；

H9-R碱基序列如SEQ No.2所示；具体为: 5′-AACAAGGGTGTTTTTGCCAATTA-3′；

新城疫病毒的扩增引物为：

NDV-F碱基序列如SEQ No.3所示；具体为: 5′-ATGGGCTCCAAACCTTCTAC-3′;

NDV-R碱基序列如SEQ No.4所示；具体为: 5′-TTGTAGTGGCTCTCATC-3′。

上述标准品的制备方法，包括以下步骤：

（1）新城疫病毒和H9N2亚型禽流感病毒分别扩增，获得目的片段TA09-HA和GM02-F；

H9-F碱基序列如SEQ No.1所示；具体为: 5′-ATTTCACAACCACTCAAGATGGAA-3′；

H9-R碱基序列如SEQ No.2所示；具体为: 5′-AACAAGGGTGTTTTTGCCAATTA-3′；