[发明专利]超顺磁纳米铁修饰的外泌体载药纳米系统及其制备和血糖响应方法

权利要求书

1.超顺磁纳米铁修饰的外泌体纳米载药系统，其特征在于，包括用于负载胰岛素促分泌药物的外泌体和超顺磁纳米铁，所述超顺磁纳米铁分布在外泌体表面，通过转铁蛋白与外泌体表面的转铁蛋白受体结合而连接到外泌体上，超顺磁纳米铁在外部磁场作用下使外泌体载体具有靶向能力和血糖响应性；所述超顺磁纳米铁修饰的外泌体纳米载药系统通过以下方法制备：

（1）羧基化壳聚糖修饰的超顺磁纳米铁的制备

将FeCl₃溶液和FeCl₂溶液按照Fe³⁺和Fe²⁺的摩尔比为1:（1.7~1.8）混合，然后加入羧基化壳聚糖搅拌均匀，羧基化壳聚糖的加入量使其在体系中的终浓度为1mg/mL，用氨水调节pH值9~10，置于70~90℃的水浴中0.5~8h，然后蒸馏水透析48小时以上进行脱盐，获得壳聚糖稳定的超顺磁纳米铁；

（2）转铁蛋白修饰的超顺磁纳米铁制备

将CS-SPION、碳二亚胺、N-羟基硫代琥珀酰亚胺钠盐按照摩尔比1:2:3混合均匀，其中，CS-SPION的摩尔量以超顺磁纳米铁的摩尔计，在室温下孵化1~1.5 h，然后加入2-巯基乙醇终止反应，经磁分离后用 PBS缓冲液重悬；然后添加CS-SPION质量的5%~10%的转铁蛋白Tf混合均匀，在3~5℃下孵育12~20h，经磁分离纯化，PBS缓冲液洗涤三次，得到转铁蛋白修饰的超顺磁纳米铁，于2~5℃储存；

（3）将超顺磁纳米铁作为靶头与外泌体结合

将外泌体在PBS缓冲液中透析12 h以上，然后按照外泌体：转铁蛋白修饰的超顺磁纳米铁的质量比为10:1的将二者混合，在3~5℃孵育6 h以上，经磁分离去除上清液，用 PBS缓冲液洗涤，得到超顺磁纳米铁修饰的外泌体纳米载药系统。

2.根据权利要求1所述超顺磁纳米铁修饰的外泌体纳米载药系统，其特征在于，超顺磁纳米铁平均粒径在10nm以下，载药系统平均粒径在为80~100nm。

3.权利要求1所述超顺磁纳米铁修饰的外泌体纳米载药系统的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）羧基化壳聚糖修饰的超顺磁纳米铁的制备

将FeCl₃溶液和FeCl₂溶液按照Fe³⁺和Fe²⁺的摩尔比为1:（1.7~1.8）混合，然后加入羧基化壳聚糖搅拌均匀，羧基化壳聚糖的加入量使其在体系中的终浓度为1mg/mL，用氨水调节pH值9~10，置于70~90℃的水浴中0.5~8h，然后蒸馏水透析48小时以上进行脱盐，获得壳聚糖稳定的超顺磁纳米铁；

（2）转铁蛋白修饰的超顺磁纳米铁制备

将CS-SPION、碳二亚胺、N-羟基硫代琥珀酰亚胺钠盐按照摩尔比1:2:3混合均匀，其中，CS-SPION的摩尔量以超顺磁纳米铁的摩尔计，在室温下孵化1~1.5 h，然后加入2-巯基乙醇终止反应，经磁分离后用 PBS缓冲液重悬；然后添加CS-SPION质量的5%~10%的转铁蛋白Tf混合均匀，在3~5℃下孵育12~20h，经磁分离纯化，PBS缓冲液洗涤三次，得到转铁蛋白修饰的超顺磁纳米铁，于2~5℃储存；

（3）将超顺磁纳米铁作为靶头与外泌体结合

将外泌体在PBS缓冲液中透析12 h以上，然后按照外泌体：转铁蛋白修饰的超顺磁纳米铁的质量比为10:1的将二者混合，在3~5℃孵育6 h以上，经磁分离去除上清液，用 PBS缓冲液洗涤，得到超顺磁纳米铁修饰的外泌体纳米载药系统。

4.根据权利要求3所述方法，其特征在于，所述的外泌体为血清外泌体。

5.根据权利要求4所述方法，其特征在于，所述血清外泌体通过超速离心方法制备：将采集的血清在2~6℃下离心25~35min，取上清液在2~6℃下离心1 ~3h，收集沉淀，用PBS缓冲液重悬（将沉淀与PBS缓冲液混匀，使沉淀均匀分散悬浮在PBS缓冲液中）即得。

6.根据权利要求3所述方法，其特征在于，所述磁分离方法是：将磁置于容器底部吸，通过磁铁与待分离体系中的纳米铁的相互吸引，将体系分为下层沉淀和上层清液体，然后去掉上清液实现分离纯化。