[发明专利]一种提高D-阿洛酮糖-3差向异构酶异源表达的方法

说明书

本发明公开了一种提高D‑阿洛酮糖3‑差向异构酶异源表达的方法，属于生物工程技术领域。本发明中D‑阿洛酮糖3‑差向异构酶的基因来源于根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)。通过密码子优化处理，将优化后的，编码DPE蛋白的基因序列(DPE(O))载入表达质粒pET22b，构建重组基因工程菌BL21(DE3)/pET22b‑DPE(O)。发明进一步优化基因工程菌诱导表达DPE蛋白的具体条件，从而确定了提高D‑阿洛酮糖‑3差向异构酶异源表达的具体方法，最后确定，在pH为8.5～9.0的LB培养基中，接种量为2％，装液量为50％时，BL21(DE3)/pET22b‑DPE(O)菌体培养3～4h后，加入0.3～0.5mM IPTG，30℃，180～200rpm条件下诱导5h，重组DPE蛋白的表达量最高,为2.1g/L。

技术领域

本发明涉及生物工程技术中的基因工程和发酵工程两个领域，具体涉及将根 癌农杆菌D-阿洛酮糖-3差向异构酶基因的密码子优化后，构建其表达载体和异 源表达宿主；对重组基因工程菌的表达条件进行优化，从而提高重组D-阿洛酮 糖-3差向异构酶蛋白的表达量；最终体外分离、纯化，获得高纯的重组D-阿洛 酮糖-3差向异构酶蛋白。

背景技术

稀有糖是指，在自然界中存在，但含量极少的一类单糖及其衍生物。稀有糖 作为新型的功能型甜味剂，已被广泛应用于膳食、医药和保健等领域。

D-阿洛酮糖是D-果糖的差向异构体，是自然界中含量非常低的稀有糖。D- 阿洛酮糖的甜度是蔗糖的70％，但是能量只有蔗糖的10％，因此，有望成为蔗 糖的理想替代品。2011年，D-阿洛酮糖被美国FDA认证可在食品和膳食领域作 为添加剂使用。

在医药领域，D-阿洛酮糖可以显著抑制血糖浓度的上升，提高葡萄糖的耐受 性；还可以抑制脂肪酶和a-糖苷酶，从而降低体内脂肪的积累。此外，D-阿洛酮 糖还具有一定的抗氧化作用，能有效地清除活性氧自由基，在治疗神经退行性等 相关疾病中也具有潜在的应用前景。

但是，D-阿洛酮糖在自然界中含量极少，外源转化是必经之路。化学途径法 由于副产物多，后续纯化及其复杂，因此，生物酶转化法是目前的研究热点。在 众多来源的酶中，来源于根癌农杆菌的D-阿洛酮糖-3差向异构酶，能够将廉价 的D-果糖转化为D-阿洛酮糖，且转化率较高，约为33.5％，且反应条件温和、 副产物少、纯化步骤简单。

近几年，来源于不同微生物的D-阿洛酮糖-3差向异构酶(D-psicose 3-epimerase,DPE)被逐渐发现，并在宿主中进行外源表达，从而获得大量的D- 阿洛酮糖-3差向异构酶蛋白。

发明内容

针对现有D-阿洛酮糖-3-差向异构酶在大肠杆菌内表达、合成过程中所存在 的宿主密码子偏好性的限制，本发明针对根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens) 来源的D-阿洛酮糖-3-差向异构酶(At-D-psicose 3-epimerase,GenBank: KX098480.1)的密码子进行分析，设定优化方案，化学合成了D-阿洛酮糖-3-差 向异构酶的新的编码序列DPE(O)。将新合成的序列导入表达载体pET22b中， 成功构建了D-阿洛酮糖-3-差向异构酶异源表达的重组宿主菌BL21(DE3)/ pET22b-DPE(O)。对基因工程菌的表达条件进行优化，从而确定了提高D-阿洛 酮糖-3差向异构酶异源表达的一种具体方法。

本发明的发明构思是：

发明人将利用大肠杆菌表达宿主异源高效表达D-阿洛酮糖-3差向异构酶蛋 白。首先，根据大肠杆菌密码子使用的偏好性，对D-阿洛酮糖-3差向异构酶基因 的密码子进行优化，构建重组基因工程菌BL21(DE3)/pET22b-DPE(O)；进一步 优化其异源表达条件，从而确定了提高D-阿洛酮糖-3差向异构酶异源表达的具体 方法。