[发明专利]一种基于CRISPR/Cas9技术获得甘蓝型油菜黄籽种质的方法

说明书

本发明属于基因工程技术领域，涉及一种基于CRISPR/Cas9技术获得甘蓝型油菜黄籽种质的方法，利用CRISPR/Cas9系统对甘蓝型油菜BnMYB123基因进行基因编辑从而获得BnMYB123基因功能缺失的黄籽甘蓝型油菜，BnMYB123在甘蓝型油菜中存在两个拷贝，其基因编码区序列如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示，序列长度为786bp。BnMYB123能够调控异鼠李素及表儿茶素的合成和积累，从而调控甘蓝型油菜的种皮颜色。本发明为油菜黄籽种质的育种工作提供了一种全新的途径，为甘蓝型油菜黄籽种质的开发提供了理论依据。

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，涉及一种基于CRISPR/Cas9技术获得甘蓝型油菜黄籽种质的方法，具体涉及利用CRISPR/Cas9系统对甘蓝型油菜BnMYB123进行基因编辑，进而改变甘蓝型油菜的种皮颜色，获得甘蓝型油菜黄籽种质。

背景技术

甘蓝型油菜(Brassica napus L.，2n＝38，AACC)为十字花科芸薹属植物，是仅次于大豆的世界第二大油料作物，在全世界的种植都非常广泛。鉴于油菜的重要经济地位及人们对植物油的需求，如何提高甘蓝型油菜的含油量、改良菜籽油和饼粕的品质已成为油菜育种的重要目标。黄籽甘蓝型油菜相对于褐籽甘蓝型油菜具有很多优良性状，如种皮薄、含油量高、蛋白含量高、纤维素和木质素含量低等优点。

天然黄籽材料常见于白菜型油菜、芥菜型油菜和埃塞俄比亚芥，在甘蓝型油菜中并没有天然的黄籽种质，目前甘蓝型油菜的黄籽材料主要来自芸薹属内部的种间杂交，黄籽种质十分匮乏。

传统的杂交育种为我国油菜的品质改良以及产量提高做出了巨大贡献，但是也存在着很多制约因素，如育种所需时间较长、劳动强度大、只能进行本物种或亲缘关系较近的物种杂交以及杂交后易出现性状分离等问题，而如今的植物基因组工程技术则为解决这些难题提供了更多更好的选择。CRISPR/Cas9系统是近几年新发展起来的一种基因编辑技术，由于其突变效率高、操作简便、成本低廉等特点，目前已经在拟南芥、水稻、玉米、小麦等植物中得到了广泛的应用。该技术不仅为基因的功能研究提供了新的思路，而且还可以应用于作物的性状改良。

发明内容

本发明的目的在于提供一种基于CRISPR/Cas9系统敲除甘蓝型油菜BnMYB123基因从而获得甘蓝型油菜黄籽种质的方法。通过敲除BnMYB123基因，抑制甘蓝型油菜种皮中异鼠李素和表儿茶素类物质的积累，从而降低种皮中原花青素的含量，导致种皮颜色变浅，呈现黄籽表型。

为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

一种基于CRISPR/Cas9技术获得甘蓝型油菜黄籽种质的方法，利用CRISPR/Cas9技术对甘蓝型油菜BnMYB123基因进行定向编辑从而得到BnMYB123基因功能缺失的甘蓝型油菜，所述方法包括如下步骤：

在甘蓝型油菜BnMYB123外显子区域选取以碱基NGG结尾的DNA片段作为靶位点，其中，N代表碱基A、G、C、T中的任意一种；

利用所述靶位点，构建用于甘蓝型油菜BnMYB123基因定向编辑的CRISPR/Cas9重组载体；

将重组载体通过电转化的方法转化根癌农杆菌GV3101中；

用所述含有重组载体的根癌农杆菌GV3101转化甘蓝型油菜，获得转基因再生植株；

对获得的转基因再生植株中BnMYB123基因包含所述靶位点的DNA区域进行扩增并测序；

选择BnMYB123两个拷贝及两个等位基因都发生编辑的再生株系，进行表型观察，获得种皮颜色变黄的株系。

进一步的，所述BnMYB123基因编码区的核苷酸序列为SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2。