[发明专利]一种靶向CD19的二代嵌合抗原受体及其表达载体与应用

说明书

本发明公开了一种靶向CD19的二代嵌合抗原受体及其表达载体与应用，涉及抗肿瘤药物的制备领域。所述二代嵌合抗原受体包括：肿瘤抗原结合结构域、胞外铰链及跨膜结构域、胞内的共刺激信号结构域、信号转导结构域；其中，所述的胞内的信号转导结构域中有三个免疫受体酪氨酸激活基序,三个ITAM上各有两个酪氨酸，分别突变其中的两个酪氨酸为脯氨酸。本发明还提供了一种二代嵌合抗原受体的表达载体，以及在抗肿瘤药物中的应用。本发明提供的嵌合抗原受体的信号转导结构域，其在体外的杀伤能力与未突变的嵌合抗原受体基本一致，但体内小鼠模型明显优于未突变的嵌合抗原受体。为临床上治疗白血病提供新的肿瘤细胞药物，也为临床上用嵌合抗原疗法治疗实体瘤提供新的设计思路。

技术领域

本申请涉及抗肿瘤药物的制备领域，具体地涉及一种靶向CD19的二代嵌合抗原受体及其表达载体与应用。

背景技术

恶性肿瘤是严重威胁人类健康的疾病之一，特别是，白血病、淋巴瘤等血液肿瘤的发病率居高不下。已用于临床治疗白血病和淋巴瘤的药物有Kymriah和Yescarta。它们在临床上达到了一定的治疗效果，但是，经其治疗后的白血病和淋巴瘤仍然会复发；并且存在细胞因子风暴，神经毒性等副反应。且病人的缓解率不够高，还需要桥接骨髓移植等其他治疗手段。

目前，已经被开发的嵌合抗原受体主要包括四个部分，肿瘤抗原结合结构域、胞外铰链及跨膜结构域、胞内的共刺激信号结构域、信号转导结构域。目前已经应用于临床的Kymriah^TM和Yescarta的共刺激信号结构域是4-1BB和CD28,以及胞内的信号传导区CD3ζ都是介导T细胞的激活信号。目前疗后的白血病和淋巴瘤仍然会复发率高的一个原因可能是双重信号刺激过度活化T细胞，加剧T细胞耗竭。这个猜想已经通过实验证实，在最近的一篇文章中，通过突变各个ITAM中的酪氨酸阻止其磷酸化和下游信号的转导，产生1XX和XX3这些含有单个ITAM的1928ζ突变体来分析CAR-T细胞功能，分化和疗效。

在急性淋巴细胞白血病小鼠模型中，ITAM突变的CAR产生的CAR-T细胞在治疗功效与1928ζ存在显著差异。通过注射低剂量CAR-T细胞比较不同CAR-T细胞的疗效。与1928ζ相比，XX3明显降低了抗肿瘤效力；而1XX超过1928ζ，诱导了小鼠的长期缓解。随着ITAM的位置向远端移动，肿瘤根除的功效逐渐降低(1XX>XX3)。1XX CAR能够快速根除肿瘤，并且在最低T细胞剂量下实现持久和完全缓解的CAR设计，而这种现象在不同的肿瘤抗原结合结构域是否是同研发的结果，目前还未可知。

发明内容

针对现有技术存在的问题，本申请提供了一种靶向CD19的二代嵌合抗原受体及其表达载体与应用，可延长T细胞在体内的存续时间，改善肿瘤治疗效果，降低肿瘤的复发率。

本申请是通过如下技术方案实现的：一种靶向CD19的二代嵌合抗原受体，所述二代嵌合抗原受体包括：肿瘤抗原结合结构域、胞外铰链及跨膜结构域、胞内共刺激信号结构域、以及胞内信号转导结构域。其中，所述胞内信号转导结构域中包含第一免疫受体酪氨酸激活基序、第二免疫受体酪氨酸激活基序、第三免疫受体酪氨酸激活基序,三个免疫受体酪氨酸激活基序上各有一个酪氨酸，所述第二免疫受体酪氨酸激活基序和第三免疫受体酪氨酸激活基序中的酪氨酸突变成脯氨酸,或者将所述第一免疫受体酪氨酸激活基序和第二个免疫受体酪氨酸激活基序上的酪氨酸突变成脯氨酸。

进一步地，所述肿瘤抗原结合结构域包括靶向CD19的单链抗体，所述单链抗体的序列为SEQ ID NO.1。

进一步地，所述胞内共刺激信号结构域包含CD28，所述胞内共刺激结构域的序列为SEQ ID NO.2。

进一步地，第二免疫受体酪氨酸激活基序和第三免疫受体酪氨酸激活基序中的酪氨酸突变成脯氨酸，该二代嵌合抗原受体的氨基酸序列为SEQ ID NO.3。