[发明专利]一种內切葡聚糖酶RuEG6及其编码基因与应用

说明书

本发明公开了一种内切葡聚糖酶RuEG6及其编码基因与应用。其中编码内切葡聚糖酶RuEG6的cDNA，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所述。本发明首次从黑莓基因组中克隆得到一种内切葡聚糖酶RuEG6的编码基因RuEG6，并验证了该基因的功能。利用植物表达载体，将本发明的RuEG6基因导入植物细胞，可获得纤维素含量降低的转基因植株。

技术领域

本发明属于植物基因工程领域，涉及一种利用黑莓内切葡聚糖酶编码基因降低植物纤维素含量的方法。

背景技术

植物在不同的生长期其细胞壁中的纤维素含量不同，不同植物细胞壁的纤维素含量也不同，而不同植物也要求一定合适的纤维素含量。一方面，纤维素在维持植物细胞的结构和强度上具有重要作用，而纤维素含量较高又对实际生产利用带来一定局限性。

如：烟叶纤维素的存在一定程度上影响了烟叶的内在品质，需要合理改善纤维素含量(蒲俊和刘彦岭，2019)。纤维素含量高的牧草适口性和可消化性较差。玉米饲料粗纤维含量高，适口性差，改善其适口性是开发其作为饲料资源的关键环节(王燕等，2016)。甜玉米果皮纤维素含量高严重影响其果皮柔嫩度(赵捷等，2018)，柑橘果肉“不化渣”也是因果肉中含高含量的纤维素导致口感粗糙(辜青青等，2016)。

因此，降低纤维素含量是提高多种植物利用率的关键措施，近年来迫切需要寻找一种有效降低纤维素含量的有效方法。纤维素酶是能够降解代谢多种多聚糖底物生成葡萄糖的一类细胞壁降解酶，植物中主要类型为内切葡聚糖酶(endo-1,4-D-glucanase,EG，也称为Cellulase,EC 3.2.1.4)(FischerBennett,1991)。纤维素酶可以降解纤维素、部分降解半纤维素以及木糖苷(半纤维素多糖)的β-1,4-葡聚糖键(Vicente et al.,2007)。纤维素酶主要广泛存在于成熟的多汁柔软浆果果实中(Huber,1983)。

目前纤维素降解多使用微生物制剂和添加纤维素酶的方法，但这需筛选适宜的降解菌菌株，也仍存在纤维素酶降解能力低、活性不稳定、产酶成本高、作用pH范围狭窄等问题，使得降解效果也有限。采用传统的杂交育种技术或人工定向选择方法改良植物的纤维素含量需要的时间长，见效慢。

通过生物技术方法实现快速改良纤维素含量成为一种可能，但目前尚未见将果实软化关键纤维素酶基因应用于降低植物纤维素含量的报道。

发明内容

本发明的目的是为了解决现有技术中存在的缺陷，提供一种经过量表达转化能够有效降低植物纤维素含量的生物技术方法。

为了实现上述目的，本发明提供了编码内切葡聚糖酶RuEG6的cDNA，它的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所述。

本发明还提供了一种内切葡聚糖酶RuEG6，它的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所述。

以及包括编码内切葡聚糖酶RuEG6的cDNA的表达载体。

特别的，上述表达载体优选将具有SEQ ID NO.1所示核苷酸序列的cDNA利用酶切连接技术插入植物表达载体pGLN得到的植物过量表达载体pGLN-RuEG6。上下游引物所用酶切位点可以是多种酶切位点引物的组合，利用在植物中表达的选择性标记基因(GUS基因)或抗生素标记物(卡那霉素标记物)的抗性基因对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选。

本发明还提供了了利用上述表达载体pGLN-RuEG6制备工程菌的方法，通过将所述表达载体pGLN-RuEG6转入根癌农杆菌EHA105，即得所述工程菌。

本发明还提供了用于扩增上述cDNA的引物，其正向引物为5’-ATGGAGAAATTTGTGAGACTCG-3’,反向引物为5’-TGAGTGCTTGTGCTTTCCTTTA-3’。

本发明还提供了上述cDNA在降低植物纤维素含量上的应用。