[发明专利]基于液相色谱-质谱分析毒品对单胺类转运体作用的方法

权利要求书

1.基于液相色谱-质谱分析毒品对单胺类转运体作用的方法，其特征在于，其包括步骤，

(1)构建DAT和SERT过表达HEK293细胞系；

(2)建立检测HEK293细胞中DA和5-HT的LC-MS/MS检测分析技术；

(3)制订毒品对DAT和SERT的重摄取抑制作用实验的操作流程；

(4)制订毒品对DAT和SERT的促释放作用实验的操作流程。

2.按权利要求1所述的方法，其特征在于，所属步骤(2)中，包括：

1)样品前处理；

2)建立DA和5-HT LC-MS/MS检测方法，其中，

色谱条件：

流动相：A相：0.01％甲酸水溶液；B相：0.01％甲酸乙腈溶液；

流速：0.25mL/min；

柱温：45℃；

进样量：10μL；

进样盘温度：5℃；

梯度洗脱条件为：

质谱条件为：

电喷雾离子源(Electrospray ion source，ESI)；喷雾电压(Spray voltage)：

正离子扫描(ESI+)3.0kV，鞘气(Sheath gas)：55Arb；辅助气(Aux gas)：5Arb。离子传输管温度(Ion transfer tube temperature)：350℃；雾化温度(Vaporizertemperature)：250℃。采用选择反应检测(Selective Reaction Monitoring，SRM)扫描分析；

使用定性、定量两种离子对待分析对化合物进行定性确证，使用定量离子对进行定量分析，各分析物的质谱优化参数为：

定量分析方法：

将样品中DA和5-HT的峰面积与其各自对应氘代内标的峰面积比值，代入各自的标准曲线方程计算样品中各自的浓度。

3.按权利要求1所述的方法，其特征在于，所属步骤(3)中，按如下操作流程：

实验前24h将分别转染表达DAT和SERT的HEK293细胞系分别进行铺板培养，细胞用预热KHB缓冲溶液清洗后分别加入含系列浓度毒品的KHB缓冲溶液37℃孵育，然后分别加入含有DA和5-HT的KHB缓冲溶液使DA终浓度为1μM，5-HT终浓度为1μM；在37℃中孵育，弃去反应溶液终止反应，；非特异性结合则分别加入含有10μM的马吲哚和10μM氟西汀的KHB缓冲溶液，以空白对照扣除非特异性结合后的值作为100％，其它加药组别扣除非特异性结合后与该值的比值作为重摄取抑制比，采用GraphPad Prism 7.0计算IC₅₀并作图。

4.按权利要求1所述的方法，其特征在于，所属步骤(4)中，按如下操作流程：

细胞用37℃预热KHB缓冲溶液清洗后分别加入含DA溶液或者5-HT KHB缓冲溶液孵育，弃反应溶液，用KHB溶液洗细胞，加入含系列浓度毒品的KHB缓冲溶液，摇床300rpm，37℃孵育，弃反应液终止反应；非特异性结合分别加入含有10μM的马吲哚和10μM氟西汀的KHB缓冲溶液，以空白对照扣除非特异性结合后的值作为100％retain，其它加药组别扣除非特异性结合后与该值的比值作为释放retain，药物的释放百分比为100％减去释放retain后的值，采用GraphPad Prism 7.0计算EC₅₀并作图。