[发明专利]一种高地芽孢杆菌J45及其获取方法与应用

说明书

本发明公开了一种高地芽孢杆菌J45及其获取方法与应用，所述的高地芽孢杆菌为高地芽胞杆菌（Bacillus altitudinis）J45，已在中国典型培养物保藏中心保藏，其保藏编号为CCTCC No.M2019666。获取方法包括分离、筛选、纯化工序，首先从烟株组织中分离能降解尼古丁的菌株，再用以尼古丁为唯一碳源的NIM培养基筛选，最后在培养基平板上纯化即得。菌株的应用包括发酵、接种、降解工序，首先将菌株在30℃下培养48~72h得发酵菌剂，于烟叶调制或制丝过程中，将发酵菌剂按烟草重量的3~5%喷施，保持4~7天的降解时间即可。所述菌株能实现烟草特有亚硝胺的高效定向降解，且抗逆性好，简便易得，使用方便，具有较高的推广应用价值。

技术领域

本发明属于微生物技术领域，具体涉及一种高地芽孢杆菌J45及其获取方法与应用。

背景技术

烟草特有的N-亚硝基类化合物（TSNAs）是一类重要的胺类化合物，其中NNN、NNK、NAB、NAT是烟草和烟气中主要的TSNAs，而NNK和NNN对啮齿动物具有强烈的癌物性。减害技术作为国际烟草的研究重点已取得了很多突破，其中主要包括农业技术中的品种选育与栽培技术、烘烤调制技术、生物技术和物理技术等，这些技术的应用可以调控TSNAs的形成量。微生物在TSNAs的形成中起着重要作用，在调制过程中改变微生物活性和数量，也必然会影响TSNAs的累积。在TSNA的两条形成途径中都有微生物在起调节作用。因此，针对烟叶调制过程或烟叶制丝过程中，烟叶或烟丝内的水、热交换特点，分离、选育一株能实现烟草特有亚硝胺碱定向降解且抗逆性好的菌株，同时结合烟叶调制过程或烟叶制丝过程中环境温、湿度变化的阶段性特征，采取适宜的施用方法，对于生产优质低害的烟叶，提高烟叶安全性和综合品质，降低烟草特有亚硝胺对人体健康及生活环境带来的危害都具有十分重要的意义。

发明内容

本发明的第一目的在于提供一株高地芽孢杆菌J45；第二目的在于提供所述的高地芽孢杆菌J45的获取方法；第三目的在于提供所述的高地芽孢杆菌J45的应用。

本发明的第一目的是这样实现的，一株高地芽胞杆菌（Bacillus altitudinis），命名为J45，经鉴定为高地芽胞杆菌（Bacillus altitudinis）的一个株系，是从烟株组织中分离得到，已于2019年8月26日保藏于中国典型培养物保藏中心（简称CCTCC，地址为：中国，武汉，中国武汉大学保藏中心，邮编430072），其保藏编号为CCTCC No. M2019666。

本发明的第二目的是这样实现的，包括分离、筛选及纯化与验证工序，具体包括：

A、分离：将烟株组织研磨后用无菌水清洗，进行表面消毒。用无菌剪刀将表面消毒的烟草叶片剪成小段，置于磷酸钾缓冲液中，用超声波处理，用纱布过滤除去烟草叶片。滤液经真空抽滤，将菌体收集滤膜上。将滤膜至于无菌水中，超声波洗脱菌体细胞。离心收集菌体，溶于无菌水中，将获得的悬浊液用稀释平板的方法分离能在分离培养基上生长的菌株；

培养条件为：25~30℃，时间40~55h；

分离培养基成分以g/L计为：琼脂12.0~18.0、K₂HPO₄ 1.4~1.8、KH₂PO₄ 0.3~0.5、NaCl 0.08~0.12、MgSO₄•7H₂O 0.1~0.3、CaCl₂ 0.04~0.06、MnSO₄•H2O 0.001~0.003、CuSO₄•5H₂O 0.0001、ZnSO₄•7H₂O 0.0002、NaMoO₄•2H₂O 0.0002、尼古丁0.8~1.2，pH 6.5~7.5；