[发明专利]一种单个活细胞内RNA出核流量的监测方法和系统

权利要求书

1.一种单个真核生物活细胞内RNA出核流量的监测方法，其特征在于，具体包括基因标记、RNA出核流量模型的构建和计算；其中：

所述的基因标记，包括在目标基因上进行基因编辑，用于标定目标检测基因，还包括构建合成示踪基因片段，用于表达示踪蛋白特异性结合目标基因及荧光显微监测；

所述构建RNA出核流量模型，即构建荧光显微监测过程中示踪蛋白在单个真核生物活细胞核内外的动态平衡模型；

所述计算RNA出核流量，根据建立的RNA出核流量模型，计算监测期内单个或细胞中RNA出核流量。

2.根据权利要求1所述的单个真核生物活细胞内RNA出核流量的监测方法，其特征在于：

所述在目标基因上进行基因编辑，就是采用锌指核酸酶技术、转录激活子样效应物核酸酶技术或CRISPR-Cas核酸酶技术，特异性地识别目标基因上选定的标记靶位点，对其单链或双链进行精准切割后，由细胞内源性的修复机制完成基因标记系统适配子的替换或添加；该适配子具有识别并招募属特定外壳蛋白到基因组位点的特性；

所述构建合成示踪基因片段，该片段编码目标真核生物受体细胞核定位序列、能与适配子特异性结合壳蛋白以及各类荧光标记物，并采用转染、感染或注射方式在真核生物受体细胞内表达前述编辑的目标基因以及示踪基因，成功表达示踪基因的真核生物细胞，能在荧光显微镜下被观测并采集，得到荧光显微强度图像；

所述目标真核生物受体细胞包括哺乳动物细胞和各类真菌；

基因标记系统包括但MS2基因标记系统、pp7基因标记系统。

3.根据权利要求2所述的单个真核生物活细胞内RNA出核流量的监测方法，其特征在于，所述RNA出核流量模型和计算方法，包括模型概念和计算公式；其中模型概念具体为：真核生物受体细胞内，示踪基因表达的示踪蛋白在荧光显微镜下被观察拍摄期间的动态分布平衡模型；示踪蛋白在细胞各处的分布浓度由前述荧光显微强度图像记录，其动态平衡模型的计算公式如下：

其中，算式左侧为所述方法的监测量，即单个活细胞内目标基因RNA出核流量；算式右侧，n_c为细胞核内示踪蛋白浓度，由细胞质内示踪蛋白荧光强度标定；k_B为玻尔兹曼常量，由国际计量大会确立；T为真核生物受体细胞的监测温度条件，在监测过程中测量得到；N为整合在目标基因上的标记系统适配子循环数，由使用者在编辑目标基因时自主选择并记录，采用基因测序方法二次确认；η为监测条件下真核生物受体细胞核附近的胞浆黏度，由真核生物受体活细胞的单分子实验确认；a为示踪蛋白分子的颗粒半径，由使用者在编辑示踪蛋白基因时自主选择并记录；S为真核生物受体细胞核孔复合物细胞质侧的中央孔径面积，采用电子显微镜测量得到；I％为示踪蛋白在真核生物受体细胞质内经过主动运输成功进入细胞核的概率，由光漂白后荧光恢复实验在真核生物受体活细胞中测量得到；k_D为基因标记系统中适配子与壳蛋白在监测条件下的结合常数，由使用者在选择基因标记系统时自主选择并测量记录；n_N为细胞质内示踪蛋白浓度，由细胞质内示踪蛋白荧光强度标定。

4.一种基于权利要求1-3之一所述监测方法的单个活细胞内RNA出核流量的监测数据处理系统，是一种基于荧光图像的RNA出核流量计算机处理分析系统，包括：

用户自定义监测变量输入的功能模块，用于明确监测的对象类型和环境条件，包括标记蛋白强度与富集浓度转换比值、整合在目标基因上的标记系统适配子循环数、监控温度条件；

荧光显微图像读取功能模块；

荧光图像中真核生物受体细胞的分选、统计功能模块，按标记蛋白在真核生物受体细胞核内外的发光强度不同，基于大津算法分选并记录核、质内的荧光强度信息；

图像数据处理功能模块，将采集得到的真核生物受体细胞核内外标记蛋白荧光强度信息经由用户输入的前述标记蛋白强度与富集浓度转换比值，换算得到核内外标记蛋白的富集浓度，结合用户输入监控温度条件，用户自定义整合在目标基因上的标记系统适配子循环数和前述RNA出核流量模型和计算方法，得到监测数据。