[发明专利]一种新型工程菌制备生物农药的方法

权利要求书

1.一种新型工程菌制备生物农药的方法，其特征在于：该新型工程菌制备生物农药的方法如下：

第一步、准备一定数量比例的金龟子绿僵菌、苏云金杆菌、嗜酸乳杆菌、多粘类芽孢杆菌，用做制备菌种；

第二步、对实验用品先进行消毒，后用无菌水擦拭用品表面，然后培养金龟子绿僵菌、苏云金杆菌、嗜酸乳杆菌、多粘类芽孢杆菌所需的固体培养基，过程要执行严格的进行无菌操作；

第三步、固体培养基制备完成后，将保藏斜面的金龟子绿僵菌、苏云金杆菌、嗜酸乳杆菌、多粘类芽孢杆菌分别放入四个培养基内，进行菌种活化，需要进行30℃-40℃的温度控制，然后培养1-3天，过程要执行严格的进行无菌操作；

第四步、进行菌种的培养，待四个活化斜面的菌种长好以后，分别挑取单菌落转接至装有液体培养基的100ml三角瓶内，在25℃下摇床培养，转速为120r/min，并培养8-24小时，过程要执行严格的进行无菌操作；

第五步、进行菌种的发酵，将四个培养好的菌种分别接种于装有液体培养基的500ml的三角瓶内，在30℃下摇床培养，转速为140r/min，并培养8-20小时，过程要执行严格的进行无菌操作；

第六步、配制金龟子绿僵菌、苏云金杆菌、嗜酸乳杆菌、多粘类芽孢杆菌混合物所需的发酵培养基；

第七步、进行四种不同菌种的混合发酵，将金龟子绿僵菌、苏云金杆菌、嗜酸乳杆菌、多粘类芽孢杆菌得到的菌种按照质量百分比进行菌种的混合，将混合后的菌种混合液接种于发酵培养基中，并将培养基放置于发酵罐中，进行发酵，控制ph值为5-7，接种数量为2%-6%，在温度25℃的环境下培养2-4天，即得到生物农药组合物。

2.根据所述权利要求1的一种新型工程菌制备生物农药的方法，其特征在于：所述金龟子绿僵菌是一种广谱性的杀虫真菌，由昆虫体壁进行主动入侵而感染不同昆虫，在昆虫血腔中可进行酵母状繁殖，产生大量虫菌体，同时可产生破坏素等杀虫毒素，抑制昆虫免疫、加速杀虫；在昆虫寄主不存在时，金龟子绿僵菌还可与植物根部形成根际共生关系而进行长期宿存，所述苏云金杆菌是包括许多变种的一类产晶体的芽孢杆菌，该菌可产生两大类毒素，即内毒素和外毒素，害虫取食后，在肠道碱性消化液作用下，菌体释放毒素，害虫中毒并停止取食，最后害虫因饥饿和血液及神经中毒死亡，用于防治直翅目、鞘翅目、双翅目、膜翅目，特别是鳞翅目的多种害虫，所述嗜酸乳杆菌主要存在小肠中，释放乳酸，乙酸和一些对有害菌起作用的抗菌素，所述多粘类芽孢杆菌在农业中的应用主要体现在两个方面，一是作为微生物肥料促进植物的生长和增产，二是作为生物农药防治植物多种病害，所述菌种的质量百分比为：金龟子绿僵菌15%-35%，苏云金杆菌20%-45%，多粘类芽孢杆菌18%-32%，嗜酸乳杆菌13%-24%。

3.根据权利要求1所述的一种新型工程菌制备生物农药的方法，其特征在于：所述实验用品的消毒应在试验前进行消毒，大型器材用消毒剂（75%乙醇溶液）擦拭表面,1分钟后用无菌水冲洗，自然干燥，其他实验用品应当在洗净后用纸包好，放入压力蒸汽灭菌器120℃灭菌20分钟方可使用。

4.根据权利要求1所述的一种新型工程菌制备生物农药的方法，其特征在于：所述无菌操作是指在无菌室中进行以防止微生物污染供试菌的操作技术，执行无菌操作前，先戴帽子、口罩、洗手，并将手擦干，注意空气和环境清洁，将操作空间中的细菌和病毒等微生物杀灭，操作过程中保证操作空间与外界隔离，避免微生物的侵入。

5.根据权利要求1所述的一种新型工程菌制备生物农药的方法，其特征在于：所述固体培养基为在含量葡萄糖0.5%-8%，蛋白胨0.3%-6%，生物素0.02%-0.06%，玉米浆0.3%-6%，牛肉膏0.3%-6%配制的所述液体培养基（培养基中各种成分的含量均为重量体积百分比，即g/100ml）中加入1.5%~2.0%左右的琼脂，加热至100℃溶解，40℃下冷却并凝固，使其成为固体状态即为固体培养基。

6.根据权利要求4所述的一种新型工程菌制备生物农药的方法，其特征在于：所述温度控制，应当把培养基放入恒温水浴锅中，来达到控制温度的效果。