[发明专利]一种多基因甲基化联合检测方法

说明书

本发明属于核酸测定技术领域，具体涉及一种多基因甲基化联合检测方法。本发明针对多个目标基因甲基化区域，在经重亚硫酸盐转化后的DNA序列上设计两组PCR引物。使用第一组引物进行一轮PCR后，产物经纯化后使用第二组引物进行二轮PCR,所得产物与杂交磁珠杂交并进行荧光标记，最后使用液相芯片平台检测。本发明采用多对引物同时进行PCR反应，通过检测偶联不同标签序列的磁珠的荧光信号来确定不同基因位点的甲基化情况，实现多重检测的目的。两次PCR扩增实现了甲基化信号的逐级放大，提高了检测的灵敏度和准确性，使样本的适用范围更加广泛。

技术领域

本发明属于核酸测定技术领域，具体涉及一种多基因甲基化联合检测方法。

背景技术

DNA甲基化是一种重要的表观遗传学修饰，在人类基因组中甲基化主要发生在CpG二核苷酸。DNA甲基化过程是在DNA甲基转移酶的催化下，将S-腺苷甲硫氨酸上的甲基转移到CpG二核苷酸的胞嘧啶(C)上，生成5-甲基胞嘧啶(5-mC)。CpG二核苷酸在人类基因组中的分布很不均一，通常位于基因启动子的CpG岛。目前常用的甲基化检测方法主要有以下几种：

1.重亚硫酸盐测序PCR(BSP)：DNA经过重亚硫酸盐处理后，设计引物对目的片段进行PCR扩增，并对PCR产物进行克隆测序，将测序序列与未经处理的序列进行比较，判断CpG位点是否发生甲基化。该方法操作繁琐，不宜大批量操作。另外，甲基化程度的定量依赖于挑选克隆的数目，因此这种方法属于一种半定量的技术方法。

2.甲基化敏感性高分辨率熔解曲线分析(MS-HRM)：DNA样本经过重亚硫酸盐处理后，甲基化与未甲基化DNA会存在序列差异，这种差异可通过熔解曲线分析发现。然而该方法对仪器的要求高，需要带HRM模块的荧光定量PCR仪，并且在进行实时定量PCR的过程中，需要使用饱和的荧光染料。利用MS-HRM技术进行甲基化检测只能对检测片段整体甲基化情况进行分析，并不能明确每个CpG位点的甲基化状态。因此这种技术适用于大量样本的检测，筛选出感兴趣的CpG位点，然后利用其他方法进行单个位点的精确检测及甲基化程度的精确定量。

3.联合重亚硫酸盐的限制性内切酶分析法(COBRA)：这种方法是将重亚硫酸盐处理与酶切相结合来进行甲基化检测。DNA样本经重亚硫酸盐处理后，利用PCR扩增。扩增产物纯化后用限制性内切酶(BstUI)消化。若其识别序列中的胞嘧啶C发生完全甲基化(5mCG5mCG)，则PCR扩增后仍为CGCG，BstUI能够识别并进行切割；若待测序列中，胞嘧啶C未发生甲基化，则PCR后转变为TGTG，BstUI识别位点丢失，不能进行切割。这样酶切产物再经电泳分离、探针杂交、扫描定量后即可计算出原样本中甲基化的比例。这种方法局限性十分明显，只能获得特殊酶切位点的甲基化情况，阴性结果并不能排除样品DNA中存在甲基化的可能。

4.荧光定量法(Methylight)：该技术是在甲基化特异性PCR(MSP)技术上发展起来的，在MSP扩增过程中利用荧光染料进行定量。其原理是针对重亚硫酸盐处理之后的DNA片段，在甲基化位点上会存在单碱基的差异，根据这种差异进行探针设计，随后进行实时定量PCR，就能够检测甲基化的差异。但是TaqMan探针订购费用较高，适用于少数位点大量样本筛选。

5.焦磷酸测序(Pyrosequencing)：焦磷酸测序作为一种新的序列分析技术，能够检测甲基化的频率，对样品中的甲基化位点进行定性及定量检测。在序列延伸过程中，根据胞嘧啶C和胸腺嘧啶T的掺入量来定量确定单个位点的C-T比例。因此，不同位点的甲基化变异就能被准确检测，并给出精确的甲基化程度的数据。但是目前来看，焦磷酸测序的片段长度还比较短，只有一百多个碱基，其中有效长度约为60bp。

发明内容

针对上述甲基化研究方法中存在的问题，本发明旨在提供一种多基因甲基化联合检测方法，其目的在于使DNA甲基化检测方法更加灵敏、准确，增加通量并更适用于微量DNA样本。

本发明提供的一种多基因甲基化联合检测方法，其中所述方法包括以下步骤：