[发明专利]DNA参照标准及其应用

说明书

本发明公开了参照DNA及其应用，所述参照DNA片段选自以下各项组成：(i)DNA片段1：其特征在于，携带确定的基因突变和至少有另一个进行了人工改变的碱基X2，其中与基因的野生型相比，所述确定的基因突变中至少有一个确定的碱基X1发生了与疾病(如肿瘤)发生、诊断和/或治疗(例如药物针对的靶点)相关的突变，所述突变是置换突变、缺失突变和/或插入突变，所述人工改变的碱基X2区别于待检样品DNA含有的、确定的与疾病发生、诊断和/或治疗相关的突变碱基X1，(ii)DNA片段2：其特征在于与DNA片段1的区别仅在于不包含所述确定的碱基X1突变，或(iii)DNA片段1和DNA片段2的混合物。

技术领域

本发明涉及细胞生物学技术领域，尤其涉及一种携带可掺入待检样本的标记和确定的基因突变的DNA片段及其应用。

背景技术

″精准医疗″已成为覆盖全球的热门学科，新生代测序技术(Next-generationsequencing，NGS)和液态活检等新技术是精准医学领域疾病发生、诊断、治疗、分类和评估的方法和技术的重要组成部分，其中，肿瘤的靶向治疗的选择和确定是目前生物医学的重要挑战之一，鉴于此，各类用途的NGS技术和试剂不断涌现。

尽管NGS技术已得到快速发展，成为药物发现和转化医学领域最常用的研究工具，并已被用于测定个体基因组序列，确认遗传疾病相关的突变和肿瘤细胞体细胞突变，但是它在突变检测的灵敏度和准确性方面仍然受到PCR和测序文库构建的多个步骤系统误差和操作错误等多种因素的限制。

在实验操作上，靶标序列富集、文库制备各个步骤和测序仪器都不可避免地引入最后得到的测序数据的变异，例如文库构建过程的多重PCR过程中DNA聚合酶对靶标序列扩增步骤引起不均匀扩增、Barcode连接过程效率低、出现高度重复读出序列，以及PCR扩增偏倚等。

在仪器方面，PCR和NGS过程中所采用的仪器的原理、性能、参数都会因实验设计而存在较大差异，同一样本使用不同厂家的仪器，或同一样本使用同一仪器、同一试剂盒，但在不同实验室，检测结果差异都会较大。

实验人员之间的误差，不同实验人员因自身经验和操作习惯上的差异，常常导致结果的差别。

在试剂盒方面，目前市场上不同厂家生产的基因突变检测试剂盒并无严格的统一的质量标准。因而，使用不同厂家或同一厂家不同批次试剂盒的检测结果也存在差异，检测结果对临床诊断和治疗的应用受到限制。

在实验室环境条件方面，不符合国家GMP标准和规范的操作流程的实验室将不可避免地会出现非样本内含物带来的干扰。

上述所有偏倚都不可避免地影响检测结果的准确性、灵敏度和重复性，导致所得数据无法准确反映原始样本DNA和RNA片段序列的质和量。

为了解决这些问题，用于NGS测序的平行实验参照(标准)品已应用于评估和校正由不同仪器、不同试剂和不同操作人员及不同实验室的测序误差，以评估每种仪器和试剂盒对每个特定位点突变检测的灵敏度和重复性。

然而这些标准品不能直接掺入待检样本，不能用于评估和校正待检样本中含有的包括置换、缺失和插入等突变的分子数，更不能排除大批待检样本中由于某一实验步骤(如文库构建、Barcode的连接效率，或某一样本反应体系的部分样本因操作错误而丢失)或仪器不均一性(如96孔PCR仪器中某一孔出现异常)导致的误差。