[发明专利]一步转化进行蓝藻基因无痕敲除的方法

说明书

本发明公开了一种一步转化进行蓝藻基因无痕敲除的方法，通过一步遗传转化将两个同向loxP序列以及序列之间包括的诱导型启动子驱动的Cre基因和选择标记基因序列替换目的基因，然后利用诱导型启动子诱导Cre重组酶的表达，最终获得无痕敲除的突变体。该方法只需要进行一步遗传转化，通过控制培养基中诱导条件来达到蓝藻基因的无痕敲除，大幅度缩短了在蓝藻中进行无痕敲除的时间，且能降低培养成本，减少抗生素使用和基因对环境的污染，也为今后更快速地开发各种优质无抗性的蓝藻工程菌底盘生物提供了一种方法。

技术领域

本发明属于微生物基因工程领域中的基因敲除技术，具体涉及一种只进行一步遗传转化就可最终实现蓝藻某个基因的无痕敲除(无抗生素标记)的方法和应用。

背景技术

蓝藻由于其能进行光合作用、遗传背景简单、生长速度快等优点，已被当成合成生物学中一个理想的底盘生物，而这就涉及到许多对蓝藻的遗传操作及基因编辑。目前在蓝藻中进行基因敲除的方法，大部分都是利用同源重组的方法将目的基因替换成抗性基因，然后在抗生素的培养条件筛选下获得纯合子。但是，这种方法的缺点主要有：1、引入了外源抗性基因，使得对目的基因的功能分析可能不准确，抗性基因的引入还可能会导致要敲除的目的基因上下游基因的表达调控产生影响，导致基因敲除突变株的产生其它不可预知的表型；2、由于突变株要花费资源去表达抗生素基因，有抗生素培养的压力会导致蓝藻突变株生长速度变慢，增加研究周期；3、培养基中添加抗生素会导致研究成本增加，更会引起环境的污染。而对蓝藻基因进行无痕迹敲除，即无抗生素基因的标记，会避免上述所有缺点，是一种最理想的基因敲除方式。

而根据现有的文献报道，在蓝藻中进行基因无痕敲除的方法，都是要经过2步或者2步以上的遗传转化才能实现，使得构建无痕敲除的周期大约是有抗性敲除周期的3～4倍。例如利用Cre-loxP位点特异性重组酶系统：首先要通过同源重组在将敲除基因的上下游引入同向的loxP序列，这一步需要进行1次或者2次的遗传转化；然后在上一步的基础上再通过1次遗传转化转入一个穿梭载体，在这个穿梭载体上表达Cre重组酶，从而将两个同向的loxP位点之间的基因切除，这样被敲除的基因就被一个loxP序列所替代，然后再在无抗性板上连续划线10代左右，将后面转入的穿梭载体去除，最终可以获得一个无任何抗性标记的敲除突变株。

发明内容

本发明的目的是提供一种在蓝藻中只进行一步遗传操作就能最终得到基因无痕敲除的方法，大幅度缩短蓝藻中进行无痕敲除的时间，解决目前已有的蓝藻无痕敲除至少需要2步遗传转化而导致构建周期过长的技术问题，也为今后更快速的开发各种优质无抗性的蓝藻工程菌底盘生物提供一种方法。

为实现上述目的，本发明通过一步遗传转化将两个同向loxP序列以及序列之间包括的诱导型启动子驱动的Cre基因和选择标记基因序列替换目的基因，然后创造性的利用诱导型启动子诱导Cre重组酶的表达，最终获得无痕敲除的突变体。具体的，本发明的技术方案如下：

一种蓝藻基因无痕敲除的方法，包括以下步骤：

(1)设计构建一个无痕敲除载体，这个载体具有核心元件FlanKA—loxP—P₁—Cre—R—loxP—FlanKB，其中：FlanKA和FlanKB代表想要敲除的蓝藻基因X上下游的同源片段；loxP是一个由两个13bp反向重复序列和中间间隔的8bp序列共同组成，其中8bp的间隔序列同时也确定了loxP的方向，本核心元件的两个loxP序列是相同方向；P₁代表诱导型启动子，能够根据培养环境中的诱导条件调控Cre重组酶的表达；R代表选择标记基因；

(2)在无诱导条件的培养基中，将无痕敲除载体转入蓝藻中，然后在无诱导条件但有选择压力的平板培养基上连续划线传代阳性克隆，获得中间纯合突变株；

(3)将中间纯合突变株在无选择压力但存在诱导条件的平板培养基上划线培养，2代后即可获得无痕敲除突变体。