[发明专利]药品质量控制中常见产毒真菌的特征序列鉴定方法

权利要求书

1.一种药品质量控制中常见产毒真菌的特征序列鉴定方法，其特征在于，所述特征序列为ITS特征序列和LSU特征序列。

2.根据权利要求1所述的药品质量控制中常见产毒真菌的特征序列鉴定方法，其特征在于，所述ITS特征序列的扩增引物序列如SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.2所示。

3.根据权利要求1所述的药品质量控制中常见产毒真菌的特征序列鉴定方法，其特征在于，所述LSU特征序列的扩增引物序列如SEQ ID NO.3～SEQ ID NO.4所示。

4.根据权利要求1所述的药品质量控制中常见产毒真菌的特征序列鉴定方法，其特征在于，包括如下步骤：

步骤一，对菌株进行分离纯化；

步骤二，提取核酸：取步骤一中的纯化后的菌株置于离心管中，研磨，然后加入CTAB缓冲液和2-巯基乙醇；水浴0.5-1.5h，然后加入饱和苯酚-氯仿-异戊醇溶液，充分颠倒混匀，-20℃冰箱放置；室温离心，取上清液置于新的离心管中；若上清液混浊，可再加入等体积饱和苯酚-氯仿-异戊醇溶液，室温离心，取上清液置于新的离心管中；再加入等体积的异丙醇溶液，颠倒使之充分混匀，室温放置2～3分钟，室温离心，弃上清；漂洗并风干加入TE缓冲液，混匀后作为核酸提取溶液，即模板DNA，置4℃冰箱中备用；

步骤三，扩增步骤二得到的模板DNA的特征序列；

步骤四，检测核酸扩增产物：采用琼脂糖凝胶电泳法检测步骤三得到的核酸扩增产物；

步骤五，纯化核酸扩增产物：将步骤四中获得的琼脂糖凝胶中的核酸扩增产物切下，置于离心管中，加入TE缓冲液，水浴至凝胶块完全溶解；分别加入乙酸钠溶液和乙二胺四乙酸二钠溶液，混匀；加入无水乙醇，静置；离心，弃去上清液；加入适量75％乙醇溶液洗涤，离心，弃去上清液，室温风干至乙醇挥发完全；加入50～200μl的TE缓冲溶液溶解，作为核酸扩增产物的纯化溶液，置4℃冰箱中备用；

步骤六，对核酸进行测序和比对分析序列：以步骤五获得的扩增引物作为测序引物，使用核酸测序仪对纯化后的核酸扩增产物进行双向测序，获得目标核酸序列，双向测序峰图采用有峰图拼接功能的软件，以正、反向核酸序列叠加的方式进行序列拼接，并去除两端引物区序列；将获得的真菌DNA特征序列进行比对分析，得到判定结果。

5.根据权利要求4所述的药品质量控制中常见产毒真菌的特征序列鉴定方法，其特征在于，步骤二中所述CTAB缓冲液的组成成分包括50mmol/L Tris-HCl pH8，0.7mol/L NaCl，10mmol/L EDTA pH8和2％CTAB。

6.根据权利要求4所述的药品质量控制中常见产毒真菌的特征序列鉴定方法，其特征在于，步骤二中所述苯酚-氯仿-异戊醇溶液中的苯酚、氯仿和异戊醇的体积比为25：24：1。

7.根据权利要求4所述的药品质量控制中常见产毒真菌的特征序列鉴定方法，其特征在于，步骤二中所述离心采用的转速为12000r/min。

8.根据权利要求4所述的药品质量控制中常见产毒真菌的特征序列鉴定方法，其特征在于，步骤三中所述扩增的体系包括：PCR反应缓冲液2.5μl，脱氧核糖核苷三磷酸2μl，正向和反向引物各2μl，模板DNA 1μl，Taq DNA聚合酶1μl，加灭菌的纯化水至25μl。

9.根据权利要求4所述的药品质量控制中常见产毒真菌的特征序列鉴定方法，其特征在于，步骤三中，所述扩增的程序为94℃预变性10分钟；94℃变性30秒，55℃退火30秒，72℃延伸30秒，29个循环；72℃继续延伸5分钟。

10.根据权利要求4所述的药品质量控制中常见产毒真菌的特征序列鉴定方法，其特征在于，步骤四中，所述琼脂糖凝胶中需加入核酸凝胶染色剂，所述染色剂为溴化乙锭或吖啶橙。