[发明专利]一种精子活性氧含量的测定方法及试剂盒

说明书

本发明公开了一种精子活性氧含量的测定方法，包括步骤如下：配置反应液，将稀释液与氯化硝基四氮唑蓝冻干粉混合，充分混匀，室温放置；取液化精液与反应液充分混匀，置于水浴箱，放置；离心，弃上清液，加入稀释液，混匀；取步骤三中试剂涂片，滴加染色液，室温反应，滴加染色缓冲液与所述染色液混匀，室温反应，洗去染液，干燥；观察步骤四中的涂片，以不含甲臜颗粒的精子作为活性氧阴性精子，含甲臜颗粒的精子作为活性氧阳性精子。观察精子，分别计数活性氧阳性精子及活性氧阴性精子数，计算活性氧阳性精子百分比；本发明观察结果完全不受精液中白细胞的影响，可以真实反映出待测精子活性氧含量。

技术领域

本发明属于精子生化指标体外检测的技术领域，涉及一种精子活性氧含量 的测定方法及试剂盒。

背景技术

精液活性氧(reactive oxygen species,简称ROS)类物质主要由精子自身和 精液中的白细胞产生，在生殖系统内，抗氧化酶系统和非酶性抗氧化物成分使 ROS的产生和清除保持动态平衡。适量的活性氧在精子功能上扮演着多种角色， 维持精子细胞的正常功能，是精子获能和顶体反应所必需的，但当ROS过量存 在时，会导致细胞氧化应激反应，损伤机体的氧化防御系统，使精子运动功能 改变、活力下降、死亡率升高，并影响精子的顶体反应及受精功能等。

现有技术中，在实验室对精子活性氧类物质(ROS)进行定量测量的方法有硫 代巴比妥酸(TBA)法、鲁米诺化学发光法、辣根过氧化物酶法等。硫代巴比妥酸 (TBA)法检测不够严谨，结果不精确，此法不便于评价活性氧的情况；鲁米诺化 学发光法为世界卫生组织推荐的方法学，但操作过程中需使用到强酸性质的鲁 米诺，对操作者、环境产生危害；辣根过氧化物酶法需使用到酸性腐蚀品三氯 乙酸，也会对操作者、环境产生危害，且需要在0℃超声处理，临床使用不方便。

为了解决上述问题，申请号为CN201711269951.9的专利精子活性氧类物质 定量测定试剂盒及其用途和使用方法，该专利中采用比色法测定精子活性氧含 量，虽然可以进行测定，但是白细胞中过氧化物酶可对活性氧测定结果产生影 响，该专利又不能排除白细胞对活性氧含量测定结果的影响。

发明内容

针对现有技术存在的问题，本发明的目的在于提供一种一种精子活性氧含 量的测定方法，通过以不含甲臜颗粒的精子作为活性氧阴性精子，含甲臜颗粒 的精子作为活性氧阳性精子，计算活性氧阳性精子百分比，可以准确评估精子 活性氧含量。

为实现上述目的，本发明的技术方案如下：

一种精子活性氧含量的测定方法，包括步骤如下：

步骤一：配置反应液，将0.2-2.0ml稀释液与氯化硝基四氮唑蓝含量为 20.0-300.0mg的冻干粉混合，充分混匀，室温放置10-30min；

步骤二：取液化精液0.1-2.0ml与所述反应液充分混匀，置于37℃水浴箱， 放置10-40min；

步骤三：200-1000g离心5-30min，弃上清液，加入稀释液0.1-2.0ml，混 匀；

步骤四：取步骤三中试剂涂片，滴加染色液0.5-5.0ml，室温反应1-2min， 滴加染色缓冲液0.5-5.0ml与所述染色液混匀，室温反应5-30min，洗去染液， 干燥；

步骤五：观察步骤四中的涂片，以不含甲臜颗粒的精子作为活性氧阴性精 子，含甲臜颗粒的精子作为活性氧阳性精子。观察不少于100个精子，分别计 数活性氧阳性精子及活性氧阴性精子数，按以下公式计算活性氧阳性精子百分 比。

进一步，所述氯化硝基四氮唑蓝冻干粉的组成成分为：包括，含氯化硝基 四氮唑蓝0.02-0.3mg/瓶、冻干保护剂、赋形剂；其中所述冻干保护剂包括海 藻糖10.0-50.0mg/瓶、牛血清白蛋白1.0-20.0mg/瓶，甘氨酸0.5-3.0mg/瓶， 所述赋形剂包括甘露醇5.0-100.0mg/瓶。