[发明专利]一种利用数字PCR检测H9N2亚型禽流感病毒含量的方法

权利要求书

1.一种用于检测H9N2亚型禽流感病毒含量的特异性引物与探针组合，其特征在于，包括以下2对特异性引物对和2条分别与引物对配合使用的特异探针，其中一对特异性引物为HA-F和HA-R，对应的探针为HA-P；另外一对特异性引物为NA-F和NA-R，对应的探针为NA-P；

其中，引物HA-F的的核苷酸序列如SEQ NO.1所示；

引物HA-R的的核苷酸序列如SEQ NO.2所示；

探针HA-P的的核苷酸序列如SEQ NO.3所示；

引物NA-F的的核苷酸序列如SEQ NO.4所示；

引物NA-R的的核苷酸序列如SEQ NO.5所示；

探针NA-P的的核苷酸序列如SEQ NO.6所示。

2.一种利用权利要求1所述的异性引物与探针组合进行数字PCR检测H9N2亚型禽流感病毒含量的方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)提取待测样品中H9N2亚型禽流感病毒HA基因和NA基因RNA，然后对该基因RNA反转录为cDNA；

(2)以此cDNA为模板，以上述HA-F、HA-R、NA-F、NA-R为引物，以上述HA-P、NA-P为探针，加入数字PCR反应缓冲液和双蒸水作为反应体系；

(3)将步骤(2)中反应体系制备微滴，然后将微滴转入PCR板，于PCR反应扩增仪中进行扩增；

(4)将扩增后的PCR板放入微滴分析仪中，检测微滴，得到H9N2亚型禽流感病毒HA基因和NA基因的拷贝数。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤(3)中的扩增条件为：95℃预变性10min，94℃变性30sec，60℃退火60sec，共40个循环，98℃延伸10min，最后4℃保温，每步都设置小于2.5℃/sec的升降温速度。

4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述反应体系为：数字PCR反应缓冲液10uL，HA-F、HA-R、NA-F和NA-R引物共3.6uL，HA-P和NA-P探针共1uL，cDNA模板2uL，双蒸水3.4uL，总体系共20uL。

5.权利要求2至4所述的任一种方法在优化无血清全悬浮MDCK细胞增值H9N2亚型禽流感病毒的技术参数中的应用，其特征在于，包括以下步骤：

将不同技术参数下无血清全悬浮MDCK细胞增值的H9N2亚型禽流感病毒样品提取H9N2亚型禽流感病毒HA基因和NA基因RNA，然后反转录为cDNA，通过权利要求2～4任一项所述的数字PCR检测H9N2亚型禽流感病毒含量的方法，测定不同技术参数下无血清全悬浮MDCK细胞增值的H9N2亚型禽流感病毒HA基因和NA基因的拷贝数，通过H9N2亚型禽流感病毒HA基因和NA基因拷贝数的差异，确定并优化无血清全悬浮MDCK细胞增值的H9N2亚型禽流感病毒的技术参数。