[发明专利]转化DNA回收率的检测方法及引物

说明书

本发明提供一种检测DNA回收率的方法，包括：1)用引物对DNA样品进行qPCR，获得转化的Ct值，其中所述DNA样品经转化以使未经修饰的胞嘧啶碱基转化为尿嘧啶碱基，所述引物识别所述DNA样品中的无胞嘧啶碱基DNA片段；和2)使用所述Ct值以及用所述引物对未转化的DNA样品进行qPCR所获得的Ct值计算DNA回收率。所述方法还包括：用识别转化后DNA的引物对经转化的DNA样品进行qPCR，获得Ct值，然后评估步骤2)中的DNA回收率。

技术领域

本发明涉及经历胞嘧啶转化的DNA回收率的检测领域。

背景技术

胞嘧啶转化例如亚硫酸氢盐转化，是利用亚硫酸氢盐化合物处理DNA，将其未经修饰(例如甲基化修饰)的胞嘧啶碱基(C)转化为尿嘧啶(U)，进而在后续PCR扩增中转化为胸腺嘧啶(T)，而甲基化修饰的胞嘧啶保持不变的体外化学反应。在利用亚硫酸氢盐化合物化学处理后，通过qPCR或者测序检测，就能知道基因组中哪些位置的胞嘧啶被甲基化修饰。因而亚硫酸氢盐转化是目前甲基化检测的最常用DNA处理方式。

亚硫酸氢盐处理除了完成上述化学变化，同时也对DNA带来大量损伤，导致DNA碎片化和降解。评估不同配比、不同厂家亚硫酸氢盐处理后的DNA回收率是评价处理试剂有效性的重要数据。目前尚无系统检测此类DNA回收率的简易方法，且缺乏不同检测之间的相互印证。

发明内容

本发明利用一对识别无胞嘧啶碱基DNA位点的引物和一对识别转化后DNA位点的引物，检测转化后DNA回收率。检测方法简单易操作，且用两种不同的检测进行相互印证。

本发明提供一种检测DNA回收率的方法，包括：

1)用引物对DNA样品进行qPCR，获得转化的Ct值，其中所述DNA样品经转化以使未经修饰的胞嘧啶碱基转化为尿嘧啶碱基，所述引物识别所述DNA样品中的无胞嘧啶碱基DNA片段；和

2)使用所述Ct值以及用所述引物对未转化的DNA样品进行qPCR所获得的Ct值计算DNA回收率。

在一个或多个实施方案中，所述方法还包括用所述引物对未转化的DNA样品进行qPCR的步骤。

在一个或多个实施方案中，所述修饰是甲基化。

在一个或多个实施方案中，所述转化使用酶促方法进行，优选脱氨酶处理。

在一个或多个实施方案中，所述转化使用非酶促方法进行，优选用亚硫酸氢盐或重硫酸盐处理，更优选使用亚硫酸氢钙、亚硫酸氢钠、亚硫酸氢钾、亚硫酸氢铵、重硫酸钠、重硫酸钾和重硫酸铵处理。

在一个或多个实施方案中，所述方法还包括，在转化前通过非酶促或酶促方法对经修饰的胞嘧啶进行保护。所述保护优选通过TET2和/或氧化增强剂进行。

在一个或多个实施方案中，所述引物包含第一引物和第二引物，第一引物不含C且第二引物不含G。所述引物在qPCR中形成的扩增产物为50-500bp，100-400bp，150-300bp或200-250bp，优选50-150bp，更优选80-100bp。

在一个或多个实施方案中，第一引物的长度为5-50、10-40、15-30或20-25个核苷酸。

在一个或多个实施方案中，第一引物不含胞嘧啶C。