[发明专利]MAR序列调控弱启动子构建高效表达载体的方法

说明书

本发明公开了一种MAR序列调控弱启动子构建高效表达载体的方法，所述方法选择不含增强子且在转录起始位点上含有CpG岛的启动子为靶启动子，用所述靶启动子替换pEGFP‑C1载体上的CMV启动子，构建中间载体，在中间载体的Ase I酶切位点插入MAR序列，构建表达载体；所述表达载体能使靶启动子表达框内的EGFP基因表达量持续稳定高效表达；本发明所述方法可以应用于抗体及蛋白药物的工业化生产领域或基因治疗的表达载体构建，提高生产效率，降低生产成本，具有良好的社会效益和经济效益。

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及用于重组抗体或蛋白药物生产等的表达载体及其构建方法，尤其涉及一种利用MAR序列调控弱启动子构建高效表达载体的方法。

背景技术

重组治疗性抗体、疫苗或蛋白药物（统称重组药）是重大疾病如癌症、类风湿关节炎、乙型肝炎和艾滋病等疾病的有效药物，这些重组药应用于市场主要存在的问题是研发和生产成本很高，导致药品价格昂贵，因此降低研发和生产成本是重组药生产的迫切需求。

重组药细胞株筛选的复杂性和生产过程中表达量下降即生产细胞株不稳定的现象，是研发和生产中的主要障碍，其关键环节在于构建稳定高效表达载体。表达载体在不同的细胞系中因整合位置和表观遗传因素引起的转基因沉默是影响重组药稳定高产的主要原因。其中表观遗传机制导致的生产不稳定尤其复杂和难以捉摸，这些表观因素包括组蛋白修饰(低乙酰化)、DNA甲基化和染色质重塑等。

通常情况下细胞表达载体的表达框中启动子常常选择启动效率高的强启动子，但是强启动子易受宿主细胞自我保护机制的抵抗，在启动子区域及关联基因附近形成阻碍基因表达的染色质修饰和染色质三维结构改变。因此克服和避免强启动子区域的染色质三维结构变化导致的表观抑制是表达载体高效和稳定表达的关键。现有技术中主要用染色质调节元件如MARs（Matrix attachment regions ，MARs)克服强启动子的沉默效应从而获得较高表达，但却未关注到调节区域染色质三维结构的改变对表达载体表达能力的综合影响。MAR序列是最早认为能将基因组在拓朴结构上分隔为不同结构域的DNA元件（Phi-Van L,1996）；MAR序列能将转基因与周围的基因组的负面作用隔绝开（绝缘功能），因此能克服转基因位置效应(Seibler,et al,2005； McKnight, et al, 1992)，能增强基因转录效率(Bode,et al, 2000)；MAR序列还能通过阻碍DNA甲基化支持组蛋白乙酰化维持长期的高转录水平(Dang, et al, 2000；Kurre，et al,2003)。可是，MARs与弱启动子结合时对表达量调控的解决方案却未见报道。

通过对基因工程中常用的真核生物强启动子特征进行分析，发现在TSS（转录起始位点）附近存在许多转录调控元件参与染色质的表观调节，这些元件是主动调节关联启动子区域染色质重塑的DNA序列。其中，增强子和CpG岛尤其重要。增强子以不同的方式影响组蛋白H3上的第4个赖氨酸（K4）、第9个赖氨酸（K9）和第36个赖氨酸（K36）的组蛋白甲基化。在增强子连接的基因编码区所有三个赖氨酸残基都高度三甲基化，而K9和K36的二甲基化不受增强子的影响；在增强子区域只在K4和K9处出现单甲基化，有别于基因编码区的组蛋白甲基化修饰。CpG岛会有选择性地募集大量染色质，CpG岛区染色质常常形成半胱胺酸甲基化缺失、低水平的组蛋白H1、高水平的组蛋白乙酰化及等无核小体区域的DNaseI高敏感性位点（Wang, B., J. Sun, et al. (2016). Small-Activating RNA Can ChangeNucleosome Positioning in Human Fibroblasts. Journal of BiomolecularScreening 21(6): 634-642；Wangbin, Hu Yunzhang (2017). Promoter-targeted smallactivated RNAs alter nucleosome positioning, , RNA activation, SpringerNature, Chapter 6）。