[发明专利]一种可视化恒温扩增产物的检测方法

说明书

本发明涉及恒温扩增检测方法，具体涉及一种可视化恒温扩增产物的检测方法。其包括以下步骤：将待测核酸样品扩增反应后，加入混合指示剂显色反应；所述的混合指示剂包括金属离子指示剂和酸碱指示剂。将待测核酸样品与反应扩增液构成反应体系在反应容器内扩增反应，所述混合指示剂置于反应容器内的反应体系上侧，反应结束摇动反应容器使混合指示剂混入反应体系进行显色反应。本发明增加阴性和阳性显色的差异，从而提高检测结果肉眼分辨的准确性，能应用于可视化恒温扩增产物检测，不需要特殊的仪器。

技术领域

本发明涉及恒温扩增检测方法，具体涉及一种可视化恒温扩增产物的检测方法。

背景技术

核酸扩增实验(Nucleic acid amplification tests,NAATs)是一种高度灵敏的分子诊断技术，在食品安全检测领域具有十分重要的地位。核酸扩增是基于核酸扩增技术检测方法的核心步骤。PCR技术是最早的核酸扩增技术，也是目前应用最广泛的核酸扩增技术。PCR需要经历“变性(高温)-退火(低温)-延伸(中温)”这个三个温度循环，因此反应依赖于精密的温控设备，这在很大程度上限制了PCR在资源有限的环境和即时(POC)分析中的应用。

近年来又产生了一系列新型的核酸恒温扩增技术(Isothermal nucleic acidamplification technology)。核酸恒温扩增技术是指在恒定温度下使核酸目标片段延伸或拷贝数增加的现代分子生物学技术。恒温扩增最大的优点在于扩增反应能在恒温条件下实现，因此对仪器的要求大大简化，通常利用水浴锅、热块即可进行扩增。同时由于不需要经历温度变化循环，扩增的反应时间也大大缩短。与PCR相比，核酸恒温扩增技术更能满足现代分子检测“快速简便”的要求，因而具有更大的发展潜力和实际应用价值。目前常用于食源性过敏原检测的等温扩增技术包括重组酶聚合酶扩增技术(recombinase polymeraseamplification.RPA)、环介导扩增技术(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)、依赖核酸序列的扩增技术(nuclear acid sequence-based amplification,NASBA)、链置换扩增技术(strand displacement amplification, SDA)、缺口依赖酶链置换扩增技术(nickase-dependent amplification,NDA)、网状分支扩增技术(ramificationamplification method,RAM)以及依赖解旋酶扩增技术(helicase-dependent isothermalamplification,HDA)等。

环介导等温扩增(LAMP)是一种新型核酸扩增方法，是一种使用能够识别靶序列上六个特异区域的引物和一种具有链置换特性的DNA聚合酶，在等温条件下进行快速、高效、高特异地扩增的技术。通过LAMP方法的核酸扩增优于PCR，有以下原因：(1)操作简便，LAMP不需要昂贵的热循环仪，因为所有反应都可以在60℃至65℃的恒定温度下进行；(2)特异性强，因为LAMP反应需要一组识别靶DNA上六个不同区域的四个寡核苷酸引物；(3)LAMP的检出限等于或高于PCR，(4)检测时间较短，因为通过使用两个特别设计的环引物可以加速LAMP反应；(5)产物易检，不需要凝胶电泳检测，因为LAMP反应导致溶液由于焦磷酸镁副产物的形成而变浑浊。溶液的浊度与合成的DNA量具有高度相关性，并且已有学者开发了用于LAMP反应的实时浊度计用于定量初始模板DNA。

在一些研究报告中，LAMP用于检测各种病原体。然而，许多研究中使用昂贵的实时浊度计或实时PCR系统进行产物检测。使用昂贵的设备降低了LAMP的多功能性，并极大地限制了该技术的广泛使用，特别是在发展中国家。通过肉眼检测浊度是判断LAMP反应阳性或阴性的最简单且最具成本效益的方法。