[发明专利]一种融合蛋白体外生物学活性的检测方法

说明书

本发明提供了一种融合蛋白体外生物学活性的检测方法，该方法采用纤维蛋白或者明胶作为包被液，对细胞培养瓶进行包被，采用AlarmarBlue作为显色液，克服了原代细胞长势差、信噪比低、四参数曲线拟合不好等难点，有效提高了融合蛋白体外生物学活性的检测方法的准确度。

技术领域

本发明涉及蛋白质医药生物工程与技术领域，涉及一种VEGFR-Fc融合蛋白体外生物学活性的检测方法。

背景技术

血管内皮生长因子(Vascular endothelial growth factor，VEGF)是目前已知的专属性最高、活性最强的血管生成因子，其可以促进血管内皮细胞的增殖和迁移，而肿瘤的生长依赖新生血管为肿瘤细胞提供所需的营养，研究表明，VEGF在肿瘤的发展过程中全程表达，因此VEGF可作为肿瘤治疗的重要靶点之一。VEGFR-Fc融合蛋白是一种由人VEGF受体的胞外区序列与人IgG1 Fc段融合形成的融合蛋白。VEGFR-Fc可以有效阻断新生血管的生成，从而使肿瘤组织由于缺乏血管的营养补给而不能正常生长。因此准确性好、灵敏度高的VEGFR-Fc融合蛋白类药物的生物学活性检测方法的建立是十分必要的。

发明内容

目前常用的VEGFR-Fc融合蛋白生物活性的检测方法有荧光素酶报告基因法以及HUVEC细胞法。报告基因法根据信号通路来模拟VEGF的作用原理进行实验设计，其不如HUVEC细胞法更为直观、更为全面的表现其对机体的生物学作用。此外，从现有文献报道来看，HUVEC细胞法测定VEGFR-Fc融合蛋白生物学活性目前存在一些问题。如HUVEC细胞属于原代细胞，培养条件不同直接影响细胞状态，进而影响实验结果；培养原代HUVEC细胞均使用市售的表面特殊处理的细胞瓶，但其对HUVEC的生长并没有明显的优势作用，细胞培养时间很长；显色体系采用的是四唑类化合物氧化还原体系进行显色，虽然显色操作方便，但造成实验本底较高，信噪比较低。有鉴于此，本发明的目的在于针对现有VEGFR-Fc融合蛋白生物活性测定方法存在的问题与不足，提供一种VEGFR-Fc融合蛋白生物活性的测定方法，为VEGFR-Fc融合蛋白生物活性检测提供了更准确，更高效的检测方法。

为实现本发明的目的，本发明采用如下技术方案：

一种VEGFR-Fc融合蛋白生物活性的检测方法，该方法中采用包被液对细胞培养瓶进行包被，使用AlarmarBlue进行显色，本发明所使用的包被溶液能够提高细胞粘附力，使其更好贴壁，且对细胞生长无副作用的粘附剂，例如纤维蛋白或者明胶，进一步优选明胶。

本发明所述的VEGFR-Fc融合蛋白生物活性的检测方法，其具体方法步骤如下：

（1）包被：吸取包被液至细胞培养瓶，使其完全覆盖细胞培养瓶底；

（2）细胞复苏、培养和传代：取HUVEC细胞进行复苏，次日换液，待细胞长满细胞瓶的70%以上时，进行传代培养；使用胰酶消化细胞，离心后重悬细胞并调整至合适的细胞密度，放入预先包被的细胞培养瓶中进行培养；

（3）细胞铺板、饥饿培养：将处于对数生长期的HUVEC细胞使用胰酶消化，离心后重悬细胞并计数调整至合适的细胞密度铺至96孔细胞培养板进行培养；

（4）参比品及供试品的制备：按照参比品和供试品溶液浓度进行稀释；

（5）rhVEGF₁₆₅溶液的制备：将rhVEGF₁₆₅稀释至一定的浓度；

（6）样品与rhVEGF₁₆₅作用：吸取稀释后相应浓度的参比品和供试品分别与rhVEGF₁₆₅等体积混匀，37℃±2℃，5%CO₂培养箱中孵育；

（7）HUVEC细胞刺激：取上述作用后的样品与rhVEGF₁₆₅混合物，分别吸取不同浓度梯度的混合溶液100μl加至饥饿培养的96孔细胞培养板进行孵育；

（8）显色：每孔加入显色液，孵育一段时间；