[发明专利]一种基于益生菌芽孢的自主纳米生成器药物组合物的制备方法及应用

权利要求书

1.一种基于益生菌芽孢的自主纳米生成器药物组合物的制备方法，其特征在于，先培养凝结芽孢杆菌使其产生芽孢，再通过酰胺化反应在芽孢表面修饰可以与胆汁酸受体结合的脱氧胆酸，随后物理负载抗肿瘤药物阿霉素和索拉非尼，即得基于益生菌芽孢的自主纳米生成器药物组合物；具体步骤如下：

（1）培养凝结芽孢杆菌：将凝结芽孢杆菌置于37℃恒温震荡培养箱，震荡速度150~180r/min，使用营养肉汁琼脂培养凝结芽孢杆菌，利用革兰氏染色法观察菌生长到对数期时，将得到的菌液收集，备用；

（2）提取芽孢：首先配置含0.005%~0.008% MnSO₄·H₂O的营养肉汁琼脂产孢培养基，然后加入体积3~5%的步骤（1）培养得到的菌液，置于37℃恒温震荡培养箱，震荡速度150~180r/min继续培养48h；用革兰氏染色法观察细菌一端开始膨大，继续培养72h，通过生物扫描电子显微镜再次监测芽孢杆菌的孢子形成程度，当有90%的益生菌形成芽孢之后，将培养的细菌芽孢混合溶液放置在60~80℃烘箱中加热30~60min，以确保能够杀死营养细胞；放置室温后，使用低温离心机在10000r/min离心30min，收集益生菌芽孢，用1M KCl、0.5M NaCl溶液洗涤2~4次，用去离子水重悬离心得到沉淀，冻干，得到芽孢粉末，备用；

（3）制备功能化芽孢：首先将30~90mg的脱氧胆酸（DA）、30~90mg 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐（EDC）和10~30mg N-羟基丁二酰亚胺（NHS）溶解于10~20mL无水乙醇中，室温反应1~2h以活化羧基，得混合溶液；然后取步骤（2）冷冻干燥的芽孢粉末30~90mg分散于10~20mL去离子水中加入混合溶液，在室温下搅拌反应24h，反应结束后用低温离心机在10000~12000r/min离心30min，得到功能化芽孢；

（4）制备自主纳米生成器及药物复合物：取步骤（3）制备得到的功能化芽孢5~10mg分散在5~10mL去离子水中，为第一混合液；将10~20mg抗肿瘤药物溶解到1~2mL去离子水中，为第二混合液；然后将第二混合液在搅拌下逐滴滴加到第一混合液中，室温下，搅拌反应24h；反应结束后，将混合液在10000~12000r/min低温离心30min，得基于益生菌芽孢的自主纳米生成器药物组合物；所述的抗肿瘤药物为：阿霉素、索拉非尼、紫杉醇、多烯紫杉醇、羟基喜树碱、米托蒽醌抗肿瘤药物的一种。