[发明专利]一种基于液态金属纳米颗粒的冷冻保护剂及其方法和应用

权利要求书

1.一种基于液态金属纳米颗粒的冷冻保护剂，其特征在于，所述冷冻保护剂为液态金属纳米颗粒、基础保护剂及培养液；所述液态金属纳米颗粒的原材料熔点在60℃以下，所述基础保护剂为乙二醇、丙二醇和海藻糖；

所述液态金属纳米颗粒的添加浓度为0.1mg/mL-0.8mg/mL；

所述基础保护剂为0.5-2mol/L的乙二醇、0.5-2mol/L的丙二醇和0.5-1.3mol/L的海藻糖；

其中，所述基础保护剂与所述培养液的体积比为(6.5-26):(93.5-74)；所述培养液以体积百分比计，为细胞培养基40％、胎牛血清60％；其中，所述细胞培养基为人骨髓间充质干细胞完全培养基、DMEM培养液、HBMSC培养液、PBS磷酸缓冲液或MEM培养液；

所述液态金属为GaIn_24.5；

所述液态金属纳米颗粒的平均直径在100-200nm范围内；

所述的冷冻保护剂中液态金属纳米颗粒的制备包括如下步骤：将分散剂用无水乙醇进行溶解，加入适量液态金属，制成混合物，将上述混合物进行超声破碎处理，使所述液态金属全部转变为液态金属纳米颗粒；将上述步骤中的液态金属纳米颗粒溶液进行离心，去掉下层沉淀，将悬浮液进行冷冻干燥得到干燥后的液态金属纳米颗粒；所述分散剂为Pluronic F-127。

2.根据权利要求1所述的冷冻保护剂对细胞或血管组织进行冷冻保存中的应用。

3.根据权利要求2所述的冷冻保护剂在人骨髓间充质干细胞、血管组织冷冻保存中的应用。

4.根据权利要求1所述的冷冻保护剂的冷冻保存方法，其特征在于，采用所述冷冻保护剂对细胞或血管组织进行冻存。

5.根据权利要求4所述的冷冻保护剂的冷冻保存方法，其特征在于，包括以下步骤：

将细胞消化、离心收集好之后用2-8℃平衡液重悬，在平衡液中平衡2-5min，然后转移到冷冻保护剂中，再立刻转移到冷冻脉管中，并迅速投入到液氮中冷冻，即完成细胞的玻璃化；或者

小鼠尾静脉注射50-150μL所述冷冻保护剂；然后将小鼠安乐死，将所述小鼠尾剪成2-10mm的小段，立即放入平衡液中，放在2-8℃环境中平衡8-15min；然后，将尾巴迅速浸没入液氮中稳定3-10min；

所述平衡液为乙二醇和丙二醇。

6.根据权利要求5所述的冷冻保护剂的冷冻保存方法，其特征在于，包括以下步骤：

将细胞消化、离心收集好之后用4℃平衡液重悬，在平衡液中平衡3min，然后转移到冷冻保护剂中，再立刻转移到冷冻脉管中，并迅速投入到液氮中冷冻，即完成细胞的玻璃化；或者

小鼠尾静脉注射100μL所述冷冻保护剂；然后将小鼠安乐死，将所述小鼠尾剪成5mm的小段，立即放入平衡液中，放在4℃环境中平衡10min；然后，将尾巴迅速浸没如液氮中稳定5分钟；

所述平衡液为1mol/L乙二醇和1mol/L丙二醇。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，对所述冷冻保护剂冷冻保存的细胞或血管组织进行解冻复温，同时给与近红外激光照射。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，包括以下步骤：

将玻璃化后的细胞从液氮中取出立即放到解冻液中复温14s，复温的同时给与近红外激光照射，之后转移到基础液中平衡2-5min，即完成冷冻细胞的解冻；或者

将血管组织从液氮中取出立即放到解冻液中复温1min，复温的同时给与近红外激光照射，之后转移到PBS溶液中平衡2-5min，即完成血管组织的解冻。

9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，包括以下步骤：

将玻璃化后的细胞从液氮中取出立即放到解冻液中复温14s，复温的同时给与近红外激光照射，之后转移到基础液中平衡3min，即完成冷冻细胞的解冻；或者

将血管组织从液氮中取出立即放到解冻液中复温1min，复温的同时给与近红外激光照射，之后转移到PBS溶液中平衡3min，即完成血管组织的解冻。