[发明专利]一种干细胞制剂和生长因子组合物及其制备方法和应用

权利要求书

1.一种干细胞制剂和生长因子组合物，其特征在于，包括间充质干细胞制剂和自体CGF，其中间充质干细胞制剂包括浓度为2-5×10⁷/ml的间充质干细胞和间充质干细胞制剂液，所述间充质干细胞制剂液包括以质量份数计的1％-5％的人血白蛋白、98.5％-94.5％的勃脉力A和0.5％肝素钠组成。

2.权利要求1所述的干细胞制剂和生长因子组合物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

S1、将含有间充质干细胞的组织处理后剪碎，接种于培养瓶底部，间隔0.5-1.0cm，将培养瓶置于常氧培养箱中孵育；

S2、24h后添加含有10-20μg/L碱性成纤维细胞生长因子的无血清完全培养基，以后隔天观察细胞，当细胞达到80-90％融合度时，将细胞消化传代；此为P0代细胞；

S3、细胞传代时，应用胰蛋白酶消化，待细胞和残余组织块悬浮后，加入无血清培养基中和；过滤细胞，收集滤液，离心，弃去上清；用无血清完全培养基重悬细胞，调整密度为1-5×10⁵/ml，接种在培养瓶中培养，将培养瓶置于低氧培养箱中孵育，此为P1代细胞；

S4、待P1代细胞到达80-90％融合度时，应用胰蛋白酶消化，待细胞悬浮后，加入无血清培养基中和；离心，弃去上清；用无血清完全培养基重悬细胞，调整密度为1-5×10⁵/mL，接种在T75培养瓶中培养；将低氧培养箱中孵育，此为P2代细胞，以此类推，培养至P3-P5代；

S5、将培养好的间充质干细胞的培养瓶，观察细胞融合度达70％-90％，弃去培养基，应用勃脉力A清洗两次后，加入胰蛋白酶消化，待细胞悬浮后，加入无血清培养基中和，收集细胞，离心，弃去上清，用勃脉力A重悬细胞，调整密度为1-5×10⁶/ml，离心，弃去上清，此为第一次细胞清洗，清洗三次后，应用干细胞制剂液重悬，调整细胞密度为2-3×10⁷/ml，分装到2mL无菌冻存管中，封装4℃低温保存，24小时内使用；每管2ml终体积，含有4-6×10⁷个细胞，此为间充质干细胞制剂；

S6、使用肝素钠抗凝负压管，抽取自体静脉血，经变速离心系统离心后得到上层的PPP，中间的液态CGF和最底层为RBC，将注射器针头插入RBC层的最顶端，抽取液态CGF，制得自体CGF。

3.权利要求1所述的干细胞制剂和生长因子组合物的制备方法，其特征在于，S6中将自体静脉血经Medifuge 200变速离心系统离心10～15分钟来制备液态CGF。

4.权利要求1所述的干细胞制剂和生长因子组合物的制备方法，其特征在于，所述的含有间充质干细胞的组织为脂肪或脐带。

5.权利要求1所述的细胞制剂和生长因子组合物在治疗骨关节炎和关节软组织损伤中的应用。

6.如权利要求5所述的应用，其特征在于，所述的骨关节炎为膝关节骨关节炎、髋关节骨关节炎或脊柱骨关节炎中的任意一种；所述的关节软组织损伤为膝关节半月板损伤或韧带损伤。

7.权利要求6所述的细胞制剂和生长因子组合物的应用，其特征在于，将1/2-2/3体积的间充质干细胞制剂和余量的自体CGF混合均匀，将总体积为4-8ml的组合物5～15分钟内注射到关节腔内。