[发明专利]一种大规模高密度悬浮培养293细胞高产腺病毒的方法

说明书

本发明公开了一种大规模高密度悬浮培养293细胞高产腺病毒的方法，先进行无血清293SFM培养，再开始CD培养基培养生产病毒，采用灌流技术和截流技术相结合，同时控制细胞培养和病毒感染的温度变化。本发明实现了细胞培养密度的扩大化，减少了细胞培养的体积，减少了后续的劳动强度，增加病毒产量，减少成本，截流过程减少细胞死亡损耗，培养过程中质量均一稳定，生产过程衔接紧密，易操控，保证批次质量稳定。

技术领域

本发明涉及生物医药技术领域，具体涉及一种大规模高密度悬浮培养293细胞高产腺病毒的方法。

背景技术

HEK293细胞是最常用的腺病毒载体包装细胞，它是用5型腺病毒75株系转化，含有Ad5 E1区的人胚肾细胞，是由加拿大McMaster University的F.L Graham与J.s.Miley于1976年用DNA转染技术构建而成。HEK293细胞是贴壁依赖性上皮样细胞，表现出典型的腺病毒转化细胞的表型，该细胞允许Ad5和其他血清型腺病毒在其内增殖。HEK293细胞为人亚三倍体细胞系，可以在无Ca²⁺或含Ca²⁺培养基中生长，也可生长在血清浓度较低的培养基中，也可经驯化使用于悬浮培养。

现有技术中，实验证实细胞传代次数过多对293细胞单层培养方式下细胞的生长以及腺病毒载体的表达量产生了明显的影响。如中国专利CN103468638B提供一种293细胞的大规模悬浮培养方法，该方法先在T形组织培养瓶中对293细胞种子进行传代扩增，再转移到搅拌式细胞培养瓶中进一步传代扩增，而后转移到5L容积生物反应器中进行培养，而后将培养得到的细胞转移接种至250L容积生物反应器中进行培养，过程中定期补加新鲜培养基用于维持培养环境适宜细胞生长。

又如中国专利CN104450607B公开了一种用于HEK293细胞悬浮生长的全化学成分培养基及培养方法，培养基组成包括氨基酸、无机盐、维生素、微量元素、碳水化合物和其他有机分子；在36.5～37℃，pH7.2～7.4，溶氧浓度45～65％条件下悬浮培养。

但该技术细胞生产腺病毒、腺相关病毒基因载体病毒等生产受限于细胞密度低和细胞产毒少导致产量少，细胞密度低细胞培养技术受营养供给、氧气、代谢影响很难得培养得到高密度的细胞，除本身以外受感染细胞与细胞生长、代谢等竞争导致产毒不高。

发明内容

本发明的目的在于克服批次产毒量少的不足，提供一种大规模高密度悬浮培养293细胞高产腺病毒的方法，获得高产量的病毒。

本发明的目的是通过下述方案来实现的：

一种大规模高密度悬浮培养293细胞高产腺病毒的方法，其特征在于，先进行无血清293SFM培养，再开始CD培养基培养，所述无血清293SFM培养的条件为：培养温度在36～38℃，pH7.0～7.4，溶氧浓度为30％～50％，培养时间为72～120h；所述CD培养基培养的条件为：培养温度为34～36℃，pH7.0～7.4，溶氧浓度30％～50％，感染48～96h收获病毒；

优选地，所述无血清293SFM培养的第45～52h开始进行灌流增加新鲜无血清293SFM，同时用细胞截流器把排除液中的细胞截流在罐体内；

优选地，所述灌流的培养速度为3～8L/d；

优选地，所述CD培养基培养8h～12h后，灌流5L～10LCD培养基，在收取病毒的前24h终止培养灌流；

优选地，所述灌流的搅拌速度为100～140rpm；

优选地，所述无血清293SFM培养的搅拌速度为80～160rpm；

优选地，所述无血清293SFM培养在第1天搅拌速度为80～100rpm，自培养第2天开始在120～160rpm的范围内逐步提高搅拌速度持续培养直到感染病毒；

优选地，所述CD培养基培养的搅拌速度为100～140rpm；